在MiSeq系统上对快速进化的甲型流感病毒进行测序-Illumina.PDFVIP

制备文库 | 测序 | 分析数据 在 MiSeq® 系统上对快速进化的甲型流感病毒 进行测序 ® 通过改良引物来优化 Nextera XT DNA Library Prep Kit，实现甲型流感病毒测序的全长、均匀 覆盖 简介 一直以来，人类甲型流感病毒都是导致发病率和死亡率的主要原 因。1,2 这主要是由于该病毒经常发生变异、避开免疫系统并让现 有的疫苗无法发挥作用。从流感基因组测序计划获得的大规模测 序结果显示，甲型流感病毒具有高度动态性，在人类群体中存在 着较高水平的遗传多样性。3 因此，持续监测人群以发现新毒株 图 1 ：扩增子远末端的较低覆盖度 - 尽管 Nextera XT 工作流程可在整个扩 以及后续研发新的疫苗，是关乎公共健康的关键举措。 增子范围内实现较高的测序覆盖度（＞ 1000×，5.1 kb 的扩增子范围内）， 但远末端显示出较低的覆盖度。8 由于甲型流感病毒具有快速进化的特性，因此，病毒测序的速度 和效率便成为了重要的考虑因素。相较于毛细管电泳（CE）测序， 新一代测序（NGS）能提供更快速的途径，并能在更广泛的动态 检测范围内提供全基因组测序数据。4 Nextera XT Sample Prep Kit 和 MiSeq 系统每次运行可处理多达 384 份样本， 提供比 CE 测序高出很多的通量，实现经济实惠且高效的样本处理。新一代 测序还能提供高分辨率的基因组数据，可用于指导疫苗建议和可 能的抗药性发生发展。5 本文将着重介绍 Hong Kai Lee 博士在新 加坡国立大学医学组织分子诊断中心 * 开发的一种方法，该方法 采用 Nextera XT 工作流程和 MiSeq 系统对人类甲型流感病毒进 行快速测序和表征。6 此方法能够快速生成扩增子文库并提供一 种技术实现较高的扩增子覆盖度——即使在扩增子具有挑战性的 远末端也能实现。尽管本研究靶定的目标是甲型流感病毒的序列， 但该设计可采用 Nextera XT Library Prep Kit 对任何感兴趣的区域 进行扩增和测序。 图 2 ：改 良 的 MBTuni-12 和 MBTuni-13 引 物 序 列 - A) 绿 色 和 蓝 色 序 列 为 Nextera 转座酶序列。灰色序列为 MBTuni-12 和 MBTuni-13 序列。B) 方法 Nextera 转座酶序列可用于改良引物以用于任何感兴趣的靶标。 引物改变 甲 型 流 感 病 毒 的 CE 测 序 需 要 采 用 两 个 之 前 公 布 的 引 物 对 了解决这一挑战难题，将独特的转座子序列添加到 MBTuni-12 和 MBTuni-12 [5-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG] 和 MBTuni-13 MBTuni-13 引物序列上，以增加远末端的表达并提供沿整个扩增 7 子更为均匀的覆盖度（图 3）。简而言之，将独特的转座子序列作 [5-ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG] 进行病毒的全基因组扩增。 这些引物靶定的是甲型流感病毒基因组的保守区域，以便于高效、 为突出端添加到 MBTuni-12 和 MBTuni-13 序列的 5- 端，以形成 可靠地进行扩增。得到的扩增子可用于 Nextera XT 工作流程，然 第一对聚合酶链式反应引物（HF 接头和 HR 接头，图 2A）。同样 后可在 MiSeq 系统上测序。然而，尽管基于转座子的文库制备方 的，为了增加实验分析方法的灵敏度，部分转座子序列添加到了 法可实现快速而轻松的文库生成，但是扩增子的远末端通常在测 MBTuni-12 和 MBTuni-13 序列的 5- 端，以形成第二对聚合酶链 序反应中不能充分表达，从而得到较低的测序覆盖度（图 1）。为 式反应引物（HF 和 HR，图