四白细胞移动抑制试验致敏的T淋巴细胞与相应的抗原反应能.DOCVIP

实验四 白细胞移动抑制试验 致敏的T淋巴细胞与相应的抗原反应，能引起代谢活化，并释放出多种有生物活性的物质。其中有抑制单核，巨噬细胞移动的因子（MIF）及抑制多型核白细胞移动的因子（LIF）。正常淋巴细胞无此反应。欲知人或动物是否存在对某种抗原的致敏T细胞——特异的细胞免疫反应，可将其淋巴细胞与抗原一起培养，从有无MIF或LIF产生来做判断。这两种细胞免疫反应（MMIF）（或迟发型变态的反应）的体外检查法分别叫做单核细胞移动抑制试验或白细胞移动抑制试验（LMIF）。人体多采用LMIF检查。 检查白细胞移动抑制因子的存在，是借其抑制白细胞移动的生物活性为指标的，依观察白细胞移动的方式不同，移动抑制试验有三种不同的方法，即毛细管法，琼脂糖打孔法及琼脂糖微滴法，这里介绍毛细管法。 将有特异细胞免疫（致敏）人的白细胞（包括各种白细胞）装入毛细玻璃管中培养，24小时后，白细胞从管中向外移动呈扇状，若培养液加入相应的抗原，能使致敏T细胞放出LIF，白细胞就不能或不能充分从管中向外移动。与不加抗原的对照相比较，显示出白细胞移动受抑制的现象。 材料 1．???? 抗原：抗原种类因实验目的不同而选定，用细胞培养液配成一定浓度供使用。本试验采用结核杆素或pHA。 2．???? 豚鼠抗凝血清 3．???? 毛细玻璃管：内径为0.8~1mm。两端粗细一致。长7.8cm 4．???? 细胞培养液：199培养液或1640培养液。 5．???? 培养小室或盖片 6．???? Hanks液。 7．???? 淋巴细胞提取液 8．???? 离心机、试管、滴管等。 方法 1．???? 淋巴细胞提取：同E形花环试验 2．???? 用无菌镊子夹毛细管，插入细胞悬液中，使细胞悬液借毛细管现象进入毛细管内，在离上端7~8mm时，将毛细管取出，装入各毛细管中，使细胞悬液高度力求相对等。 3．???? 将毛细管空端经火焰封固端朝下置试管中，于水平离心机内1000转/5，10分钟。取出毛细管可见细胞被压紧里4~6mm高的柱，表层发白主要是白细胞，下层发红为红、白细胞混合存在。用小砂轮在毛细管壁的细胞——液体界面处划痕，小心折断。将溢满细胞的毛细管蘸少许凡士林，置平底凹玻中固定，每凹放2~8只毛细管，而后滴加培养液，将毛细管分为两组，每组3~4支，一组为实验组，另一组为对照组。试验组用199培养加适量抗原作培养液，对照组只用199液作培养液，不加抗原。 4．???? 凹孔上加盖玻片封闭，勿留有气泡，将凹玻片置于铺有湿布纱布的铝盒中，置37℃温箱中培养18~22hr。 5．???? 取出凹玻片，用解剖显微镜测定各毛细管白细胞移动的扇面之长短直径。试验结果用移动指数MI表示： 正常值80~120% ??????? 80%以下皆为抑制，即移动抑制阳性。 ??????? 120%以下皆为刺激，刺激反应的产生可能是抗原浓度偏低。 ? ? ? 实验五 淋巴细胞转化试验 正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中受到特异性抗原或有丝分裂原刺激。可转化为淋巴母细胞。细胞免疫缺陷时，患恶性肿瘤或某些其他疾病时。转化率显然降低。目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂原来检测受试者的淋巴细胞转化率，从而判定其细胞免疫功能，称为PHA刺激淋巴细胞转化实验。 材料： （1）?????????? 肝素（每毫升含100单位） （2）?????????? 199培养液（内含20%灭活小牛血清。青霉素100单位/毫升链霉素100微克/毫升） （3）?????????? PHA（每毫升含1000微克） （4）?????????? 无菌注射器及针头、试管、吸管。 方法： （1）???? 采肝素抗凝血1—2毫升（1毫升血中加肝素20单位）充分混匀。37℃静置1—2小时。红细胞沉淀后，吸取血浆层并捎带些红细胞。移入另一无菌试管中。计算白细胞数然后2000rpm离心10分钟。弃上清液。用199培养液将沉淀的白细胞配成1ⅹ107/毫升细胞悬液。 （2）???? 取细胞悬液0.6毫升（6ⅹ106细胞）加入含有2.4毫升199培养液的培养瓶中。 （3）???? 按每毫升营养液加30ugPHA加入PHA。 （4）???? 37℃孵育68—72小时。培养过程中，每天翻动培养瓶1-2次。 （5）???? 培养后。振荡培养瓶。将细胞重新悬起，然后移入试管中。 （6）???? 1000rpm离心5分钟。 （7）???? 尽量弃去上清液，将沉淀物混匀，取一滴放在载玻片上，推成血膜（头、体、尾分明）干燥，用瑞特氏染液染色）镜检。 （8）???? 计算淋巴细胞的转化率：油镜下观察每张玻片的头、体、尾三段。每段各一纵列（目的是减少推片中细胞分布不均的误差）。 图13 每张玻片记数200—400个细胞，计算转化率其中头部50—100，体部50—100，