细菌内毒素与热原检查法.pptVIP

加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37摄氏度水浴中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟. 结果判定： 将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。 鲎试剂灵敏度复核 如最大2.0λ浓度管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性， 按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。　 λc＝lg-1(ΣX/4) 式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后四个呈阳性的结果浓度。 结果记录 阴性 0.5 0.25 0.125 0.0625 - + + - - - + + - - - + + - - - + - - - 举例计算 内毒素稀释液浓度 d(EU/ml) X(lgd) 0.25 -0.60206 0.25 -0.60206 0.25 -0.60206 0.5 -0.30103 举例计算 ∑X=﹣2.10721 λс=lg-1(-2.10721/4)=0.297 测定值在标示值的50%——200%之间，所标示灵敏度可被确认，此批鲎试剂可用于供试品的细菌内毒素检查。 细菌内毒素和热原检查法 郝树彬 基础知识 热原：注入人体后可引起发热反应的物质。 1 材料的致热性。 2 因微生物污染造成的热原反应。 热原的检查方法 体内热原检查法——兔温法（PT) ——是一种体内的、全热原的检查方法。1942年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使用。 体外热原检查法（ITP) ——是一种体外的利用人血细胞反应的全热原检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。 细菌内毒素检查法（BET) ——医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热原。 热原分类——按检查法分 内毒素热原 ——革兰氏阴性细菌细胞壁的组分 非内毒素热原 ——除内毒素外的热原 热原检查法（家兔法）可用于检测上述两种原因产生的热原反应。 细菌内毒素检查法只检测产品的细菌内毒素含量。 试验验证未发现输液器材料的致热性，临床发生的热原反应均为细菌内毒素污染造成的。因此对输液器成品可采用细菌内毒素检查法进行热原初试。 热原通常是指能够致热的微生物的尸体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。 细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物，复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性。 热原的致热机理：细菌内毒素，病毒，细菌及其他微生物，类固醇或某些材料释放热原质，作用于动物体单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内生性热原，作用于下丘脑体温调节中枢，结果使动物体温升高。 热原反应给临床治疗带来极大的危害，一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即会出现高热症状，反应严重者会造成死亡，故必须严格控制。 细菌内毒素的理化性质 1 耐热性：180~200摄氏度2小时干热可完全破坏。（药典为250摄氏度至少1小时。） 2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器。 3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。 4 不挥发性 5 被吸附性：可被树脂等吸附除去。 6 被酸碱破坏 7 被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时，可完全破坏。 细菌内毒素生物活性 致热性 致死性 引起血液白细胞中的粒细胞下降 激活凝血系统 血压下降 诱导机体对内毒素的耐受 引起淋巴细胞的有丝分裂 诱导抗感染的非特异性 杀死肿瘤细胞 与鲎试剂反应 细菌内毒素检查法 概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效的方法，其优点在于： 1 科学性：有生物化学的理论基础。 2 准确性：是酶的分子生化反应，专属性高，重现性强。 3 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵敏度极高， 当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。 4 实用性：方法快速，操作简单，无需特殊仪器设备，经济实用。 由于细菌内毒素检查法的优越性，已被广泛应用于临床检验。 实验目的： 据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断医疗器械或其浸提液中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，医疗器械/材料须经热原实验评价证实无材料致热性，同时经测定证实样品对细菌内毒素试验无干扰作用后，才能采用该方法。 实验原理 细菌内毒素在钙离子，镁离子参与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因子激活b因子，活化的b因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。 内毒素 C因子 活化c