实验六鼠骨髓细胞染色体标本的制备.pptVIP

1．掌握好秋水仙素的浓度和处理时间，浓度过高，处理时间过长，都会使染色体过分收缩，不利于形态观察。2．控制好离心的转速，一般以1000r/min为宜，转速过大，会造成细胞结块，不利于染色体伸展；转速过小，细胞不能充分沉淀，会造成细胞分裂相丢失。3．低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失，不能准确计数。低渗处理时间不足，则细胞内染色体聚集一起，不能很好伸展开来，观察时无法区辨和计数。4．固定液要现配现用，固定要充分。5．载玻片要洁净，无油脂和预先冰冻，滴片要有一定的高度，以利于细胞和染色体充分分散。 实验六 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 杭州师范大学 刘姬艳 一、实验目的 通过小白鼠骨髓细胞染色体的制备，初 步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体 的方法 2.熟悉染色体的形态、种类及小白鼠等动 物染色体的数目及特点 二、实验原理 骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞 中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体 的形态特征、数目进行准确的观察和分析。 由于小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种 血细胞的原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一 材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染 色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行 染色体组型分析。 首先,为了获得较多的中期分裂相骨髓细胞,必须给动 物注射一定剂量的秋水仙素。秋水仙素对分裂期纺锤丝的 形成具有破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙素后,处于 分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝不能形成,中期染色体不 能正常趋向两极,因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳 的分裂中期。其次,为了能够清楚的观察染色体的形态，取 出的骨髓细胞要经过低渗(KCl溶液)处理使细胞膨胀、染色 体适当的分散。固定(甲醇:冰醋酸)使染色体保持完好的形 态。染色(Giemsa液)使染色体易分辨、观察。 二、实验原理(continued) 1.材料：小白鼠 2.试剂：0.01﹪秋水仙素,0.4%氯化钾 (KCl), Carnoy固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),Giemsa染 液，0.01M磷酸缓冲液(pH 6.8)，2%柠檬酸钠。 3.器材：离心机、显微镜、剪刀、解剖刀、小镊 子、注射器及针头、刻度离心管、吸管、载玻 片和盖玻片、染色缸、玻片盒 三、实验用品 四、实验步骤 1.预处理：实验前2.5-3小时，按每克体重注射0.02ml， 给小白鼠腹腔注射秋水仙素。 2.断颈处死动物. 3.剥取股骨和胫骨，剔去肌肉组织，剪去两端的股 骨头 4.冲洗骨髓：吸取2%柠檬酸钠,注射器针头插入骨 一端,反复冲洗骨髓,取8ml至离心管中.1200rpm 离心5min,弃上清. 5.低渗：加入8mL 0.4% KCl溶液,37oC低渗20分钟， 中间（约10分钟）用吸管吹打二次，使细胞分 散，悬浮于溶液中。 6.离心：1200rpm离心5分钟后弃去上清液， 7.固定：加8ml固定液并用吸管轻轻吹匀，室温下静 置20分钟，每10分钟时吹打一次。 8.离心：1200rpm离心6分钟，弃上清液。 9.离心：加1.5mL固定液，吸管吹打成细胞悬液。 10.滴片：用吸管吸取细胞悬液，滴在预冷的载玻 片上，室温晾干 11.染色：10% Giemsa染液染色30分钟 四、实验步骤(continued) 在显微镜下观察Giemsa染色之后的染色体 片(染色体呈紫红色)，找出分散适度的中期染色 体图象, 观察小白鼠的染色体形态，统计其染色 体数目。 制得好的标本应是细胞多、颜色为紫红色。 此时间期细胞由于低渗和固定处理，细胞膜和质 已被去掉，镜下看到的仅为膨胀后呈圆形的细胞 核。分裂期细胞染色体集中在一起，其外也无细 胞膜包裹，染色体之间无重叠，易分辨，臂的长 度适中。但最重要的是分裂相要多。 五、实验结果 ? 几种动物染色体形态特征 动物名称 染色体数 染色体类型 x染色体形态 y染色体形态 青蛙 26 中央、亚中央着丝粒染色体 中央着丝粒染色体，介于6～7号 中央着丝粒染色体，介于8～9号 小白鼠 40 全部为近端着丝粒染色体 大小介于5～6号 大小介于19～20号 大白鼠 42 中央、亚中央近端着丝粒染色体 近端着丝粒染色体，介于4～5号 近端着丝粒染色体，介于18～19号 家兔 44 中央、亚中央近端着丝粒染色体 亚中央着丝粒染色体，介于5～6号 近端着丝粒染色体，介于19～20号 六、注意事项 低渗与离心等步骤的操作要轻。 观察细胞的标准为： 1.细胞完整