壳聚糖酶的研究进展与应用.PPT

壳聚糖酶的研究进展 目 录 1.前言 2.壳聚糖酶的简介 3.壳聚糖酶的研究进展 1.前言 壳聚糖(chitosan)是由D- 氨基葡萄糖通过β-１，４糖苷键连接而成的线性多糖，由于其相对分子量较大，不易溶于水，在机体内不易被吸收，使其应用受到很大限制。 壳寡糖(chitooligosaccharides)是壳聚糖进一步降解形成的产物，具有较低的分子量，呈水溶性，容易被机体吸收，是一种功能性低聚糖，具有壳聚糖无法比拟的特性。 研究发现，低分子量壳寡糖（如五糖、六糖）具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，这使其在功能食品、医药、化妆品等领域有着广泛的应用前景[1] 。 现在制备壳寡糖的方法主要有两种：化学降解法和酶解法。其中酶解法因条件温和、选择性高，对环境污染小，产物安全性好，受到学术界越来越多的重视与关注。如今，酶法水解壳聚糖制备壳寡糖已成为甲壳素领域的一个研究热点。 壳聚糖酶是酶法水解壳聚糖制备壳寡糖的专一性酶。本文综述了目前壳聚糖酶的研究概况，以及通过酶法制取壳寡糖的发展现状，同时展望了其应用前景。 2.壳聚糖酶的简介 2.1．壳聚糖酶的概念 壳聚糖酶(chitosanase)是分解壳聚糖的专一性酶，是20世纪70年代初发现的一种新酶。它是由Monaghan于1973年在研究细菌和真菌过程中首先提出来的。壳聚糖酶不同于几丁质酶，它能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖，生成壳寡糖。 2.2．壳聚糖酶的分布 壳聚糖酶在细菌、真菌和病毒等微生物类群中均有存在，但大多数微生物产壳聚糖酶的活性低，分离和提纯的技术比较复杂，使生产成本相对较高，从而影响壳聚糖的酶法生产。 2.3．壳聚糖酶的理化性质 微生物壳聚糖酶的分子质量一般为10～50ku。同时也存在少数分子量较高的壳聚糖酶，如曲霉Aspergillussp CJ-22-326合成两种壳聚糖酶，其中外切酶的相对分子质量高达109ku[2]，另一种由Trichoderma reesei PC-3-7合成的外切壳聚糖酶的相对分子质量也有93ku[3]。 壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，等电点(pI)变化范围比较大，在4.0～10.1之间。大多数微生物的壳聚糖酶具有较好的热稳定性，且最适反应温度一般为30～70℃， 如Thermococcu skodakaraensis KOD1所产壳聚糖酶的耐热性很好，其最适反应温度高达 80℃[4]。 2.4．壳聚糖酶的分类 根据壳聚糖酶的作用模型可分为内切型和外切型两种。内切型壳聚糖酶以释放二聚体、三聚体或低聚糖为主，外切型则从壳聚糖的非还原末端产生单糖残基-氨基葡萄糖[5]。壳聚糖酶对壳聚糖的降解，产物一般为二至八糖的壳聚糖。 3.壳聚糖酶的研究进展 3.1.壳聚糖酶的获取 近年来，科学家已从微生物中开发出了许多种壳聚糖酶，但这些酶的生产成本普遍比较昂贵，且难以实现商业化应用。目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶，基因表达大多受阻遏物/诱导物系统控制，一般以壳聚糖为诱导物，它们的降解产物为阻遏物。天然菌株产壳聚糖酶的能力一般较低，因此现在大多都使用诱变育种以获取较为理想的壳聚糖酶。 孙金凤[6]研究组以从自然界中筛选得到的一株壳聚糖酶活为9.84 nkat/mL的芽孢杆菌属菌株为出发菌株，经硫酸二乙酯（DES）诱变处理后，筛选得到壳聚糖酶活明显提高的突变株DES-4，其壳聚糖酶活为26.67 nkat/mL，是出发菌株的2.7倍。 王艳[7]等曾以假单胞菌Y8.0为出发菌株，分别通过亚硝基胍（NTG）、Co60、UV诱变，获得的突变株Y8，其酶活力达到50.01 nkat/mL，提高近6倍，并具有较好的遗传稳定性。 甘肃省天水师范学院利用紫外线诱变不同稀释度的黑曲霉菌液后，筛选得到一株酶活力较强的菌株A3，其酶活为52.34 nkat/mL，是出发菌株的1.42倍[8]。 3.2.壳聚糖酶的分离纯化 目前，壳聚糖酶常用的分离纯化方法有分级盐析、凝胶过滤层析和离子交换层析等。我国在壳聚糖酶分离纯化方面已经做了许多研究，如天津科技大学通过硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25凝胶过滤层析、DEAE Cellulose 52离子交换层析，对曲霉TCCC45017产的壳聚糖酶进行分离纯化和性质研究。得到的酶纯化倍数为57.21，回收率为26.55%，比活力提高至578.55U/mg[9]。 3.3.壳聚糖酶的固定化 对于壳