几种甲壳纲动物感光器中Gq蛋白α亚基的研究.docVIP

几种甲壳纲动物感光器中Gq蛋白α亚基的研究 第30卷第4期 2001年12月 上悔师范大学(自然科学版) JournalofShanghaiT~ehersUnive~ity(NaturalSciences) V0I1.o D200l 几种甲壳纲动物感光器中 Gq蛋白亚基的研究 章骏,袁维佳,许燕 (上海师范大学生帝与环境科学学院.上海200234) 摘要:报道丁甲壳纲几种常见动物的视网膜为材料,用免疫印迹法验证了长尾类动物 罗氏沼虾和日本沼虾的视网膜中具有Gq蛋白的d亚基,Gq”抗体在42kDa处识别了一条 蛋白条带.短尾粪动物中华域螯蟹的视网膜中没有检测到Gq蛋白的d亚基.同样的方法 在罗氏沼虾的眼柄蛋白中没有检测到Gq蛋白的n亚基.不同光照处理罗氏沼虾的复眼. 暗适应后视网膜中的Gq蛋白的d亚基含量明显少于光适应状态时其中的Gq蛋白的n 亚基含量. 美键词:Gqa;视网膜;免疫印迹;罗氏沼虾;日本沼虾;中华缄螯蟹 中图分类号:Q513文献标识码:A文章编号:i000—5137(2001)04—007305 0引言 异源三聚体G蛋白是由a,,3个亚基组成的三聚体,它在许多类型的信号转导中起重要作 用.G蛋白的类型很多,有激活腺苷酸环化酶的Gs,抑制腺苷酸环化酶的Gi,在脑和心脏中含量丰 富的Go以及脊椎动物视觉细胞中的Gt等.J. Gq是最近几年发现的一种G蛋白类型,存在于许多无脊椎动物的视觉细胞中它在动物的光 电传导过程中起着重要的介导作用.Gqa的移位被认为是控制感光器敏感度的重要分子机制之一 Gq在甲壳纲动物的视觉细胞中也有发现,l993年,TERAKITA用免疫沉淀法标记了螯虾感光器 中的Gq蛋白的a亚基J,l998年又用同样的方法研究了螯虾感光器中的Gq蛋白的p亚基,并且分 析了它的部分序列J.Gq蛋白是否在甲壳动物的感光器中普遍存在或另有其他形式,还有待做大 量研究. 在以前的实验中对几种甲壳动物的视网膜蛋白进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳,发 现其中有一条分子量为42kDa的蛋白条带存在.这与以往论文中报道的Gq蛋白n亚基的分子量 是相同的.本实验用免疫印迹法来进一步确证其感光器中Gq蛋白的存在,并通过不同光照处理来 研究其是否与光电传导有关,为无脊椎动物的感光机理提供资料. 收稿日期:2001一O1—12 基金项目:教育部青年骨干教师资助项目(BL200013) 作者简介:章骏(1978一),女,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生I袁维住(1957)男,上海师范 大学生命与环境科学学院教授 上海师范大学t自然科学版) 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物 成年,健康罗氏沼虾(Maerobroxhiumrosenbergii),日本沼虾(Macrobrachiumnipporu,nse)及中 华绒螯蟹(EriochirSinensisHMilne—Edwar~)购自上海农贸市场. 兔抗Gqa多克隆抗体(c端序列:QINIKEYNIV)为Sigma公司产品,二抗辣根过氧化物酶 标记的羊抗兔IgG及底物二氨基联苯胺(DAB)购自华美生物工程公司,蛋白质转膜用的硝酸纤 维薄膜购自上海生物工程试剂公司,其余试剂均为进口分装或国产分析纯. 1.2方法 ].2,l光适应与暗适应处理 购买来的新鲜罗氏沼虾分为两组,一组于日光下光适应4h后解剖复跟,另一组置于全暗的环 境中饲养1天,次日于微弱的红光下解剖复跟口]. 日本沼虾与中华绒螯蟹光适应4h后解剖复眼. 1.0.2样品处理 活体状态下切除实验动物的复眼,剥除外层角膜,剔除神经组织,将视紫红质部分放人冷冻的 含蛋白酶抑制荆的缓冲液中(3mmo1/LMgC1,2mmol/I乙二醇双乙胺醚一N,N’四乙酸. 10mmol/I三羟甲基氨基甲烷,10g-g/mI亮抑蛋白酶肽,76.8nmol/I,丝抑蛋白酶肽,07gt;mol/I 胃抑蛋白酶肽,lmmol/L碘乙酰胺,0.23mmoi/L苯甲基磺酰氟,1表面活化剂,pH82)置于球 箱,冷冻过夜.解冻之后,离心样品(100,000g/m,4c).30min后得到上清液]. 取罗氏沼虾眼柄中的蛋白,用同样方法处理. 暗适应的罗氏沼虾于微弱的红光下处理,步骤同上. 1.2.3蛋白质浓度的测定 采用紫外吸收法测定蛋白质的浓度. 1.2.4十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE) 取等量蛋白加样品缓冲液于i00C水浴5min,进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(分 离胶l0,浓缩胶5). 1.2.5免疫印迹法鉴定Gq 电泳结束后取一半胶用0.25考马斯亮蓝R一250染色,另一半胶用半干式电转移仪将蛋白质 转移至硝酸纤维薄膜上(20mA,lh),丽春红染色,封闭液(含5牛血清蛋白的PBs)封闭2h.加一