实验八核酶的定点突变研究.pptVIP

实验八 核酸酶的定点突变研究 石陆娥 shilue@126.com 一、实验目的 1.通过本实验学习定点突变的基本原理和实验技术。 2.熟练掌握PCR实验技术。 二、实验原理 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。 定点突变原理图 在本实验中我们以来自于Yersinia enterocolitica subsp.Palearctica 的一种核酸酶（Y.NSN）基因为模板进行突变，该核酸酶具有较高的酶活，然而来自于 Yersinia. enterocolitica subsp. Enterocolitica 8081的另外一种核酸酶则具有较低的酶活，所以，通过氨基酸序列比对，对两种核酸酶有差异的氨基酸进行点突变，来探究氨基酸残基对Y.NSN酶活的影响。 如下图所示，有15个位点的氨基酸有差异，在这里我们仅选取其中的一处来进行突变以便来掌握定点突变的技术。 二、实验器材 1.菌种 DH5α感受态 2.材料 DNA模板（重组质粒pet24a）, PCR预混液，引物对（正向引物和反向引物），Dpn I（10U/ul），琼脂糖，GenStar的切胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，卡那霉素(50mg/ml)，loading buffer, LB培养基 3.器材 PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像仪，紫外分光光度计，立式压力蒸汽灭菌器，恒温培养箱，恒温培养摇床，电子天平，电动离心机，医用型洁净工作台。 三、实验步骤 1. PCR反应 （1）50ul反应体系 DNA模板 (质粒pet24a) 1ul 正向引物（10 uM） 1ul 反向引物（10 uM） 1ul 2×Pfu PCR StarMix 25ul ddH2O 22ul （2） 反应条件： 95℃ 30sec 95℃ 30sec X℃ 1min(X为退火温度,由引物的Tm值决定) 72℃ 6min 72℃ 5min 4℃ 无限 2→4 重复15个循环 2.PCR扩增反应完成后，在样品中加10ul loading buffer 全部跑电泳并用切胶回收试剂盒回收目的片段。 3.加入1ul（10U/ul）DpnⅠ,离心混匀1min,37℃温育1-3小时。 4.转化 5.测序 挑取2-3个单菌落至1.5ml离心管（1ml LB+lul卡那）中，震荡培养20个小时后取600ul菌液送去测序。 6.突变质粒提取 待测序正确后，将剩余的400ul菌液加入20mlLB+20ul卡那（锥形瓶）中扩大培养，大约4个小时后，OD600约为0.8-1.0，用质粒提取试剂盒提取质粒，然后将质粒于-20度保存。 希望上面的内容对你有帮助