酵母菌地制片和观察.doc

实用标准文案 精彩文档 酵母菌的染色与观察 摘要：本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察酵母形态和出芽生殖方式，并区分酵母菌死活细胞。以生长在麦氏培养基上的酿酒酵母为材料，采用Schaeffer-Fulton氏染色法，进行子囊孢子的观察。 关键词：酵母菌 水浸片法 子囊孢子 出芽生殖 前言 酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明且分化，个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖有芽殖、裂殖和产生孢子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊孢子。美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。 子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏 (McClary) 培养基 ( 葡萄糖－醋酸钠培养基 ) 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。 1材料 1.1菌种 酿酒酵母麦氏琼脂斜面培养物。 1.2溶液和试剂 葡萄糖，KCl，酵母浸膏，醋酸钠，琼脂，蒸馏水，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，0.01%美兰水溶液。 1.3仪器和其他用品 酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，烧杯，试管等。 2实验步骤 2.1培养基的制备 2.1.1麦氏琼脂培养基的制备 麦氏（Meclary）琼脂培养基的配方如下： 成分 葡萄糖 KCl 酵母浸膏 醋酸钠 琼脂 蒸馏水 含量 0.2g 0.36g 0.5g. 1.64g 4g 200mL 113℃灭菌30min 2.1.2液体培养基的制备 取0.5g酵母膏、1g蛋白胨、2g葡萄糖加入100ml水配制成液体培养基。 2.2斜面接种 无菌操作由酿酒酵母麦氏琼脂斜面培养物挑取菌种，在已冷凝好的斜面培养基上划线接种。 2.3培养 在28℃条件下恒温培养7d 2.4美蓝染液水浸片法 2.4.1制片 在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，无菌操作法取培养基中培养的酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。用镊子夹盖玻片一块，小心盖在液滴上。 2.4.2镜检 将制好的水浸片放置3min后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。30min后再次观察。 2.5子囊孢子观察 2.5.1制片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜。 2.5.2干燥固定 待涂片自然干燥后，让菌膜朝上，通过火焰2～3次进行固定（以不烫手为宜）。 2.5.3染色 加5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，染色1~1.5min。 2.5.4水洗 用缓流自来水轻轻冲洗，直至流出的水无色为止。 2.5.5乙醇脱色 用95%的乙醇脱色30s，立即用水洗去乙醇。 2.5.6复染 用0.5%番红液染色30s~1min。 2.5.7水洗 用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止。 2.5.8镜检 将载玻片晾干后，先低倍再高倍，最后在油镜观察酵母菌。 3结果与分析 3.1实验结果 3.1.1美蓝浸片观察实验结果（见图1、2） 在高倍显微镜下可以看到，酿酒酵母菌为单细胞，呈卵圆形或圆形，个体较大，细胞内有明显的液泡。酵母菌无性繁殖主要是出芽生殖，出芽时，由母细胞生出小突起，为芽体(芽孢子)。 活着的酵母菌细胞呈现无色，死亡的酵母菌细胞被染成蓝色。因为美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的。用它来对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。 在30min后观察该片，蓝色细胞增多。得出美蓝染液的作用时间会使酿酒酵母的死细胞增多，细胞死、活比例增大。 芽体出芽细胞 芽体 出芽细胞 图1 酵母菌形态结构（10×40） 图2-1 美蓝水浸片3min（10×40） 图2-2美蓝水浸片30min（10×40） 3.1.2 子囊孢子观察实验结果（见图3及分析） 子囊子囊孢子局部放大图 子囊 子囊孢子 局部放大图