分子生物学第一次讨论人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析与其应用.pptVIP

第一次讨论课 （2） 第3组 口腔1401班 原理 方法 注意事项 结果鉴定 人类细胞质RNA提取 原理 方法 RT-PCR的原理、方法 原理 结果分析 应用 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 人类细胞质RNA提取 真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。 RNA提取实质就是将细胞裂 解，释放RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质最终获得高纯度RNA产物的过程。 AAAAAA AAAAAA tRNA mRNA rRNA 人类细胞质RNA提取 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。在分离RNA的过程中，用抑制剂以抑制RNA酶的活性。 RNA提取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃或液氮中保存样品，取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。 建立一个无RNA酶的环境 Trizol法 * DEPC,焦碳酸二乙酯 RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的活性基团组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液体试剂都应该用DEPC处理。 有效浓度：0.05%---0.1%，室温磁力搅拌20分钟。 灭活条件：高压消毒，或70 ?C 1 h。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 ?C ，或液氮中。 人类细胞质RNA提取 Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物。 异硫氰酸胍可裂解细胞，并使RNA与蛋白质分离。酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。 人类细胞质RNA提取 破碎组织 分离RNA 沉淀RNA 融解RNA 保存RNA 洗涤RNA 可以用盐酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎组织 加入β-ME可抑制RNA酶的活性 一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，离心。RNA分层于上部。 一般用乙醇、3M NaAc 或异丙醇 使用70%乙醇洗涤，洗涤后可以晒干或烤干乙醇（但是不能过于干燥，否则不易溶解） 人类细胞质RNA提取 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活 人类细胞质RNA提取 全程佩戴一次性手套。皮肤带有细菌和外源性核糖核酸酶，可能污染RNA。 * 内因：核糖残基的2’和3’位置带有羟基，易被水解 外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活 人类细胞质RNA提取 完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。 若两条带不明显, 则说明RNA部分降解。 人类细胞质RNA提取 RT-PCR 原理及方法 逆转录PCR原理及方法 知识背景 基因表达 RT-PCR原理简介 RNA cDNA 目的 片段 PCR RT 实质——聚合酶链式反应（PCR）广泛应用的变形. 知识背景 RT (reverse transcription ） 即逆转录，指以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。逆转录过程是RNA病毒的复制形式之一，需逆转录酶的催化。 RNA cDNA 逆转录 RT 逆转录酶的选择 RNA cDNA 逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1.依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； 2.Rnase水解活性：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子； 3.依赖DNA的DNA聚合酶活性:以反转录合