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七 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性

实验七 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性 3.了解测定血清谷丙转氨酶活性的临床意义 1.掌握金氏法测定血清谷丙转氨酶活性的原理 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定具体操作方法 将α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α-酮基上,生成相应的酮酸与氨基酸的反应。催化这一反应的酶称为转氨酶。 转氨作用: 也称氨基转移酶,是一组催化氨基在?-氨基酸与?-酮酸之间转移的酶。是一种细胞内酶,当细胞膜通透性增加或细胞死亡时释放到血液中。 转氨酶 转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中,谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的活性均较高。在正常的新陈代谢过程中,血清内两种酶维持一定水平的转氨酶活性(即正常值)。 转氨作用的机制: 体内主要两种转氨酶? 谷丙转氨酶(GPT)又称丙氨酸转氨酶(ALT) 谷草转氨酶(GOT)又称天冬氨酸转氨酶(AST) 肝脏 心脏 谷丙转氨酶:催化谷氨酸和丙氨酸之间的转化的转氨酶,其结构式反应如下: 血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义 谷丙转氨酶广泛存在于机体各组织中。正常人血清中此酶浓度活性很低,肝细胞中该酶浓度活性极高,当肝细胞受损时此酶从细胞中释放血。因此测定血清ALT活性对于某些疾病的诊断和预后判断具有重要的参考价值。 (1)血清ALT活性增高:肝胆疾病、药物和毒物 (2)ALT活性降低:磷酸吡哆醛缺乏症。 ALT在临床上主要用于肝脏疾病的诊断 酶活性:是指在规定条件下,单位时间内底物的减少量或产物的生成量。即酶反应速度。 酶活性的影响因素 样品处理 测定条件 溶血 抗凝剂 存放时间 温度 pH 时间 底物浓度 酶浓度 常用的谷丙转氨酶酶活性测定方法有: 1 金氏法(King法) 2 赖氏法(Mohun 法) 3 改良穆氏法(Reitman-Frankel法) 共同点:原理、试剂、操作步骤和作用时间相似。 不同点:在于单位定义和标准曲线绘制方法不同,因此测定结果的单位数值不同。 在37℃,1ml血清与底物作用60min,生成1μmol丙酮酸为1个活性单位 第一步反应: 第二步反应: 520nm CH3 α-丙酮酸 2 标准曲线的制备 1 测定酶活性 试剂 试管编号 测定管 对照管 丙氨酸氨基转移酶底物液(ml) 0.5 0.5 置于37℃ 水浴中预温5min 血清(ml) 0.1 置于37℃水浴60min —— 2,4一二硝基苯肼溶液(ml) 0.5 0.5 血清(ml) —— 0.1 各管混匀后,置于37℃ 水浴中保温20min 0.4 mol/L NaOH溶液(ml) 5.0 5.0 混匀,10min后,30min内在520nm处比色,以对照管调零,读取测定管吸光度值。 1 测定酶活性 取试管2支,按下表3-13操作 表3-13 试剂 试管编号 1 2 3 4 5 6 2 μmol /L丙酮酸标准液(ml) —— 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 谷丙转氨酶底物液(ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1mol/L磷酸缓冲液(ml) 相当于丙酮酸实际量 (μmol) 0.10 0 0.10 0.10 0.10 0.20 0.10 0.30 0.10 0.40 0.10 0.50 各管混匀后 2,4一二硝基苯肼溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 各管混匀后,置于37℃ 水浴中保温20min。 0.4 mol/L NaOH溶液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀,10min后,30min内在520nm处比色。以第1管调零,读取各管吸光度值。 2 标准曲线的制备 取6支试管,编号,按下表3-12步骤操作: 表3-12 试管编号 1 2 3 4 5 6 吸光度(A) 丙酮酸含量 ( μmol ) 试管编号 对照管 测定管 吸光度(A) 表2 丙酮酸标准曲线的绘制 表1 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性 原始数据记录 1 标准曲线图绘制 1)用坐标纸绘制标准曲线 2)标明操作人、时间、仪器型号和图表名称 1.标准曲线图绘制 1.标准曲线要过原点 2.注明标准曲线名称

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