肽指纹图谱.PPT

质谱测试分析 蛋白质质谱鉴定流程 胰蛋白酶酶解 采用含乙腈的脱色液脱色至胶块变为白色 真空干燥仪中冷冻干燥 蛋白质组学级胰蛋白酶酶解过夜 采用含TFA和乙腈的溶液溶进行肽提取 真空干燥 采用含TFA和乙腈的溶液溶解样品并点样进行质谱测试 质谱分析 ABI MALDI-TOF/TOF 4800 质谱仪 先用MS反射模式得到一级图谱 一级质谱激光总shots: 800次 选择5-10个母离子做MS/MS分析 二级MS/MS激光总shots: 2000次，碰撞能量1KV, CID on 数据库检索 采用GPS Explore (V3.6 ，ABI) 软件进行分析 使用MASCOT（V2.1, Matrix Science, London, U.K）搜库软件对本地数据库进行检索 检索数据库为NCBInr，切割的酶为trypsin ，允许最大的未被酶切位点数为1, 可变修饰为半胱氨酸乙酰胺化和甲硫氨酸氧化，没有固定修饰，母离子质量容差为50 ppm，片段离子质量容差为0.25Da 肽指纹图谱（PMF）鉴定 PMF（Peptide Mass Fingerprinting）是根据一级质谱（MS）所测酶解片段的精确分子质量鉴定蛋白质的一种方法 一般采用MALDI-TOF进行鉴定。因为MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算 其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息与实际测得的质量信息进行对比而实现鉴定 优点与缺点 优点： 是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法，算法简单，速度快 缺点： 质量相近的多肽增加匹配难度 无法实现混合蛋白的鉴定 二级质谱鉴定 质谱仪选择一级质谱中的一个峰，让这些峰所代表的离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽键断裂，并对库搜索鉴定蛋白质 常用MALDI-TOF／TOF仪器进行 优点与缺点 优点： 鉴定准确度更高，可以得到蛋白的序列 可以实现多个蛋白的鉴定 缺点： 增加了一步操作 算法更复杂，而且需要更多的操作经验 蛋白的选择 一般以protein score C.I.%大于95或者单个肽段的Total Ion C.I.%大于95作为蛋白成功的标准 对于一个样品点鉴定得到多个成功鉴定的结果，以蛋白得分（ protein score ）最高的最为可信 一般而言，多个成功鉴定的不同蛋白之间相似性也是非常高的，也可以通过这个特点来判定结果的可靠性 蛋白信息查询 首先根据蛋白名称可以了解该蛋白的大致功能 使用该蛋白的GI号码可以到NCBI数据库进一步查询该蛋白的信息 对于未知蛋白，可以采用BLAST或者其它功能预测软件预测该蛋白的功能 * * 样品 酶解 酶解片断 一级质谱 PMF 肽指纹图谱 串联质谱 对库 检索 序列数据库 成功鉴定 PSMs及后筛选 De-novo 序列分析 未知蛋白 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 串联质谱结果 ——质谱图 从一级质谱图里选出部分峰做二级质谱 一级质谱图 二级质谱图 上海博苑生物科技有限公司 蛋白点编号 蛋白名称 蛋白GI号 串联质谱匹配的序列 理论等电点 理论分子量 串联质谱离子得分 可信度 串联质谱结果 ——报告单 蛋白得分 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司