环境激素硫丹的生殖毒性及影响机制研究-环境科学与工程专业论文.docxVIP

摘要 - I - 摘要 硫丹是被联合国环保署列入的环境激素名单中 16 种有机氯农药之一， 也是在全球已有广泛分布，是所检测的 22 种有机氯化合物中残留浓度最高 的 2 种之一。硫丹目前已经为国际认同 并将列入持久性有机污染物 （ Persistant Organic Pollutants， POPs），由于硫丹的杀虫谱广，杀虫效果 好，随着其他有机氯农药的禁用，用量还有逐渐增加的趋势。伴随着硫丹的 长时间和大量使用，其对生态环境的污染和对人体健康的潜在影响应进行研 究。迄今为止国内外对硫丹的毒性研究主要集中在一般毒性研究方面，而生 殖毒性的研究很少见报道，尤其是对雄性生殖功能的影响更为少见，其生殖 毒性研究不系统且毒性机制尚无定论。因此开展硫丹雄性生殖毒性及机制的 研究具有重要的学术价值和现实意义。 本课题采用毒理学手段对硫丹生殖毒性进行了系统观察，首次采用激光 共聚焦显微镜技术对硫丹致生精细胞凋亡超微结构进行研究找出其毒性靶 点，并首次采用免疫组化等方法从分子水平研究了硫丹致生殖毒性的机制和 遗传毒性，为硫丹进行生殖毒性危险度科学的评价，阐明仍被广泛应用的环 境激素硫丹与生殖毒性的关系及作用机制，为筛选硫丹暴露者生殖毒性分子 生物标志物、阻断生殖毒性途径提供新思路及为寻找防治生殖毒性的药物作 用靶点、建立防治生殖毒性对策提供科学依据。 （1）明确了硫丹的雄性生殖毒性和中毒剂量。首先通过硫丹半数致死 量（LD50）的测定及硫丹对小鼠睾丸组织损伤和精子生成的影响，生殖功能 相关激素水平及相关磷酸酶的测定，系统地研究了其雄性生殖毒性。利用改 进寇氏法测定了硫丹的半数致死量（LD50）为 13.96mg/kg，LD50 的 95%可 信限为 11.14～ 16.78mg/kg，这表明硫丹经口染毒，属于高毒有机氯杀虫 剂。表明硫丹可通过环境激素效应干扰内分泌而致生殖毒性。 （2）证明了硫丹引起生精功能障碍与其促生精细胞凋亡，引起精子数 目减少，活力下降有关。通过激光扫描共聚焦显微镜生精细胞的形态学超微 结构观察证明其毒性作用靶点为生精细胞的线粒体。琼脂糖凝胶电泳检测到 DNA 梯带，二苯胺法测定到各染毒组 DNA 降解率显著升高。 哈尔滨工业大学工学博士学位论文 - II - （3）用分子水平方法分析了硫丹通过引起钙稳态紊乱达到促生精细胞 凋亡的毒性机制。利用 Fluo-3 能特异性地与细胞内 Ca2+结合并激发产生荧 光的特性，检测到生精细胞内 Ca2+浓度远远高于细胞外浓度。比色法检测 到 Na+-K+-ATPase 及 Ca2+-Mg2+-ATPase 活力显著下降，一氧化氮（NO）浓 度及一氧化氮合酶（cNOS）活性增加，说明硫丹在致细胞钙稳态失衡后， 可激活 cNOS 活性，引起 NO 含量上升，通过 N- 甲基 -D- 天冬氨酸 （NMDA）-Ca2+-NO 途径导致细胞凋亡。γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）活性增 强，说明硫丹在致细胞钙稳态失衡后，可使 γ-谷氨酰转肽酶的表达增多， 从而促进凋亡小体的形成。用免疫组化法检测到核因子-кB（NF-кB）的表 达减少，说明硫丹可在致细胞钙稳态失衡后，可能通过激活需钙蛋白酶Ⅰ、 Ⅱ来抑制核因子-кB 的表达，从而促进凋亡的发生。采用免疫组化法测定 p53 蛋白在生精细胞中的表达。硫丹染毒组精原细胞 p53 表达率明显增高， 提示硫丹可能是通过 p53 途径致精原细胞凋亡的，从而使精子数目减少。 （4）发现了硫丹通过引起 DNA 损伤而导致染色体畸变，提示硫丹的 遗传毒性。通过荧光染色，激光共聚焦显微镜检测，硫丹染毒小鼠生精细胞 的 RNA/DNA 比值明显增高。溴化乙锭法检测得硫丹致使生精细胞 DNA 交 联率增高，并在一定剂量范围内，交联率与剂量呈线性方程关系。 关键词 环境激素；硫丹；生精细胞凋亡；钙稳态失衡；DNA 损伤 Abstract -  PAGE 7 - Abstract Endosulfan is one of the 16 kinds of organochlorine pesticides that have included in the list of environmental hormones by the United Nations. Endosulfan is also one of the two highest residual concentration in the World in 22 kinds of organochlorine compounds. Nowadays, endosulfan is generally accepted persistence contaminant and will