环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛β细胞损伤的保护作用研究-内科学(内分泌与代谢病)专业论文.docxVIP

天津医科大学博士研究生学位论文环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠 天津医科大学博士研究生学位论文 环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠 胰岛P细胞损伤的保护作用研究 摘 要 我们近几年在临床上开展的。肾活检、皮肤活检和肌肉活检都证明，糖尿病人 体内存在广泛的多器官免疫损伤。多年来，糖尿病的防治都是以高血糖为中心的 治疗策略，因此糖尿病的慢性并发症的发病机理和临床处理都处于思想茫然和束 手无策的尴尬境地。为弄清糖尿病发病机理，更好地从疾病的源头预防和治疗糖 尿病及其并发症，我们开展了糖尿病多器官的病理免疫学的研究并尝试用环孢素 A进行干预。本试验是整个研究的一部分。 第一部分环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛功能障碍的作用 目的：建立链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠模型；观察 小剂量环孢素A(Cyelosporin～CsA)联合胰岛素治疗对糖尿病大鼠胰岛功能盼、 保护作用以及CsA治疗的副作用。 方法：雄性SD大鼠40只，随机分为5组，即正常对照(CON)组；糖尿 病对照(DM)组，不给予任何干预措施；单纯胰岛素治疗(INS)组，予中效 胰岛素8U／d皮下注射；单纯环孢素A治疗(CsA)组，予环孢素A1 m∥(kg．d) 皮下注射；联合治疗(CpI)组，同时给予上述剂量的环孢素A和中效胰岛素。 干预4周后处死。每周监测体重，定期监测血糖，24 h尿微量白蛋白定量测定， 4周时行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素激发试验(停用胰岛素3日)， 处死前取血检测肝肾功能和电解质。通过对胰腺组织的特殊染色(HE和AzON)、 免疫组织化学胰岛素抗体染色和透射电镜检测观察大鼠胰岛形态学变化。 结果：32只造模大鼠全部成模。干预4周时，INS和CpI组随机血糖明显 低于DM组，CpI组随机血糖低于CsA和INS组。CpI组大鼠胰岛面积和胰岛素 蛋白表达均高于DM和CsA组，较INS组有升高的趋势(_P值分别为O．056和 0．057)。 OGTT结果。OGTT各点cpI和INS组大鼠血糖都低于糖尿病组；cpI组大 鼠空腹和120 min血糖与INS组无差别，30和60 min血糖低于INS组。OGTT 天津医科大学博士研究生学位论文 天津医科大学博士研究生学位论文 葡萄糖曲线下面积的结果为，DM组(70．21：L14．47)、INS组(50．21：t：8．79)、C。pI 组(38．724-3．98)和CON组(22．554-1．25)，组间差别具有统计学意义。胰岛素 激发试验，CpI和INS组在高糖刺激下的胰岛素释放高于DM组；CpI组大鼠试 验30和60min血清胰岛素水平高于INS组。6细胞功能指标，cp]组60min胰 岛素分泌指数(InsE60)高于DM和INS组；Cpl组B细胞功能指数(HBCI)高 于DM组，与INS组之间无统计学差异；各组糖尿病大鼠之间InsE30无差别。 形态学观察。光镜HE、AZON染色和透射电镜的研究结论一致，即CpI组 6细胞结构更接近于正常对照组结构，胰岛病变较INS组改善更加明显。 生化检查。Cpl和INS组大鼠血清总胆红素低于DM和csA组；cpI组24h 尿微量白蛋白低于DM和INS组；CpI和INS组尿素氮水平低于DM组，而Cpl 组血肌酐低于DM和INS组。 结论：①STZ诱导的糖尿病大鼠模型成立；②小剂量CsA(1mg．kg．d)具 有对糖尿病大鼠胰岛6细胞的保护效应，这一作用需要外源性胰岛素的辅助；③ CsA对糖尿病大鼠的肾保护作用不仅仅依赖于血糖控制；④以l mg／(蛞．d)的 CsA治疗4周末造成糖尿病大鼠的肝肾功能损害。 关键词：糖尿病环孢素A胰岛素B细胞 口服葡萄糖耐量试验 第二部分环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠免疫功能的作用 目的：在得到了小剂量CsA具有B细胞保护作用的结论后，本节继续探讨CsA 对STZ诱导糖尿病大鼠胰腺局部和相关淋巴结免疫功能的影响。 方法：实验动物和分组同上。取液氮保存的胰腺组织，提取蛋白，sDs．PAGE 蛋白电泳以考马斯亮蓝染色鉴定有无降解，以Western Blotting法鉴定胰腺组织中 DCs特异性表面标志物——CDln的蛋白表达水平，结果以B．aetin的蛋白表达进行 校正。糖尿病组大鼠，依次取出胰腺引流淋巴结(PDLN)、肠系膜淋巴结(sI．N) 和脾脏的左侧1／2，行淋巴细胞转化试验；每组每个部位设立细胞对照孔和ConA (20肛g／mL)刺激孔各8复孔，胎牛血清浓度为10％。T淋巴细胞体外培养68h， 离心并留上清备测IL-2；以含MTT的细胞培养液继续培养4h，MTT比色法测定T 淋巴细胞增殖活性。取PDLN来源的ConA束U激孔T淋巴细胞培养上清测定IL．2浓 H 蒌鎏墅型