重组蛋白纯化SOP.docxVIP

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻 方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH） 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，直至菌体溶液变清澈为止 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1） 超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2） 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 2.3 GST融合蛋白的纯化 以PGEX融合表达载体表达的GST融合蛋白，可用谷胱甘肽－亲和层析介质纯化。GE公司的谷胱甘肽亲和介质是用10个碳原子连接臂和谷胱甘肽作为配体连接到4%交联的琼脂糖凝胶上，专门用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和色谱填料。 1．GE公司谷胱甘肽填料的性质： 基质 4%的交联琼脂糖凝胶 吸附载量 10mg GST融合蛋白/ml 亲和填料的颗粒大小 90μm 最大流速 450cm/h pH范围 3-12 使用温度 常温 保存温度 +4~30 保存液体 20%乙醇 化学稳定性 室温1M乙酸盐，6?M盐酸胍条件下稳定1h 实验过程中，可根据填料的吸附容量决定上样量，根据填料的其他特性保存填料 2 缓冲液及样品准备 2.1 缓冲液 Binding Buffer ：PBS pH 7.3 ( 140mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2 Elution Buffer：50 mM Tris-HCl ,10 mM 注：如有需要，结合及洗脱液中可加入1-10 mM 2.2 样品 样品上柱前要于10000rpm 下离心10分钟或经0.45μm的滤膜过滤后才能上样。如果进行批量纯化时可不必过滤。若样品黏度较大，可用结合缓冲液适当稀释。 3 批量纯化 3.1 介质的准备 (1) 取1mlGST琼脂糖凝胶制成50%混悬液 (2) 用移液管转移到离心管里500×g 离心5min，小心倾去上清。 (3) 加入5ml PBS 混匀介质进行洗涤。(4) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心倾去上清。 (5) 重复洗涤一次。 3.2 批量纯化 (1) 向GST琼脂糖凝胶里加入细胞裂解液（根据目的蛋白表达量和介质的吸附容量决定上样量），轻轻混匀，使GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的充分结合，4度旋转孵育3小时（可进行实验确定）。 (2) 用吸管将混合物转移到另一离心管中， (3) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心倾去上清，取20μl上清液（即流穿液）进行SDS以分析介质的结合效率。 (4) 加入5ml PBS 混匀，洗涤。 (5) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心倾去上清（洗涤液），取20μl上清液SDS分析。 (6) 重复步骤4、5两次。 (7) 加入0.5ml Elution Buffer，轻轻混匀，室温孵育20min。 (8) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心收集上清（洗脱液）。 (9) 重复步骤4、5两次，分别检测三次洗脱上清中目的蛋白的含量，根据结果合并含量较多的上清液。 3.3 注意事项 (1) GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量，很重要的一点就是保证足够作用时间。不同的GS