免疫组化10.pptVIP

IH复习提纲 一、内容要点 （一）基本知识 免疫组织化学是一门研究利用核素或非核素标记物作为显示手段，并借助免疫化学或亲合化学的专一性和高灵敏性，原位示踪组织或细胞中的抗原或抗体的应用科学，本质上是一项敏感、特异的原位示踪染色技术。 特点：特异、敏感（ng或pg水平），原位、形态-机能一代谢三位一体。 技术方法类型多样，彼此通用，各有特点。以标记物种类分：放射免疫自显影，免疫荧光、免疫酶标、亲合免疫酶标、络合放大免疫酶标（CSA 、 Epos 、 EnVision 、 UIP） 、 免疫重金属标记（胶体金、铁蛋白），等 等。 目前应用较广且较为敏感的技术有PAP、S-P、sABC、IGSS（间接法）和EnVision法等。 一般来说，免疫光镜多采用S-P（间接法）、sABC法-HPO、IGSS法（间接法）和EnVision（间接法）；免疫电镜多采用IGS法（间接－－包埋后）。 主要试剂为抗体，有特异性抗体（第一抗体、示踪试剂）、桥连抗体（第二抗体，放大试剂）和标记抗体（第三抗体、显示试剂）等。目前商品化抗体多属单克隆抗体，应用中必需注意种系匹配和免疫学亲和对应原理。 （二）组织处理和切片选择 免疫组织化学中组织处理的原则是“ 保留抗原、维护结构”； 操作中注意“ 及时固定、温和短时”；“ 石蜡优先，冰冻跟上”；“ 暴露决定簇，阻断内源干扰”。 ▲（三）方法原理与选择根据 免疫组化染色方法类型众多，基本原理大同小异，但由于标记交联显示方法的不同，其技术的检测敏感性上存在某些差异，可按工作实际与实验室条件，加以选用。 目前文献中仍以酶标记应用报道最多，尤其是与亲合物的结合。例如LSAB－HPO间接法，sABC-HPO法，LSAB-AKP法， sABC -AKP法，其次是PAP法或APAAP法，IGSS间接法。 免疫荧光间接法尚有一定应用价值，仍可见于诸文献报道。免疫胶体金间接法（5nm或10nm）主要应用于免疫电镜。 新近，为了适应快速IH诊断的需要，采用高分子葡聚糖作交联载件，预先连接标记酶和抗体，组成巨大免疫示踪试剂分子，使免疫组化染色操作流程大大简化和标准化，并由于检测复合物的分子量的增大而进一步提高了方法的灵敏度。该方法现命名为EnVision染色法，可分直接法（一步法）和间接法（二步法）二类。 酶标亲合素（sA） 生物素（B）化二抗 一抗 Ag ABC-HPO b-Ab2 Ab1 Ag PAP Ab2 Ab1 Ag 银显影 G －Ab2 Ab1 Ag 方法选择可根据检测抗原的量与脆性而定，抗原含量高，抗性强则允许选择放大效率低的染色法（如间接法），若抗原含量少，脆性大的膜抗原或微量抗原则多选择复合物法或亲合标记法，甚至在底物显色反应前重复免疫操作流程，以进一步提高染色方法的灵敏度，降低检测阈值，如双PAP法、双APAAP法、PAP－ABC法等。 免疫电镜则多选择电子密度高的IGS间接法，透射电镜的免疫组化，包埋前法需注意改善细胞膜的穿透性，包埋后法则强调抗原的保护，前后固定剂选择要求温和、短时、有效，必要时可不用锇酸后固定或铅铀复染。 显色剂与标记酶要专一，应用中还需注意试剂的溶解特性，正确选择封片方式。 ★（四）对照染色十分重要、关键，涉及IH染色结果的正确判定和假阳性，假阴性异常错误结果的识别。 常用的免疫组化的对照，有阳性组织对照、阴性组织对照，阴性试剂对照（主要是特异性抗体）和自身组织对照，尤以阴性试剂对照最为重要。 预实验，特别是稀少抗原的检测，首创性的研究工作，阴性试剂对照的类型尽可能多选做几种，以说明实验结果和所用试剂的特异性和可靠性。正式实验为节省工作量，可只做空白对照，其结果必需为阴性。 原位PCR（一般常用间接法，先PCR核酸扩增，后ISH）的对照，基本上同一般原位分子杂交法。 ★（五）质量要求 （1）特异染色鲜明、清晰，背景本底较弱，二者反差明显，比值1。 （2）阳性显色定位正确。 （3）对照染色结果附合要求，阴性试剂对照必需是阴性结果。 ▲（六）增强特异性染色 特异性染色结果不佳或缺如（阴性）的主要原因是组织处理不当，抗原或信号丢失，其次是方法灵敏度不足，或试剂，操作不当，底物陈旧等。 增强特异性染色的措施一般有： （1）延长染色孵育时间，特别是一抗。 （2）多重孵育反应（即重复主要血清流程）。 （3）降低背景（洗涤或稀释缓冲液中加入0.2～1％ Triton×-100或1％BSA；10％正常血清或1％BSA预孵育等）。 （4）提高组织细胞的通透性（如冻融、提高稀释缓冲液的离子浓度和渗透压等）。