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四 .结果与讨论 TEBV移植后的平滑肌细胞的迁移和重塑成型过程 因为移植平滑肌细胞可以增加TEBV的机械性质 但是自体平滑肌移植需要相当多的时间 又有人通过动物实验证明，在植入物植入后，附近的平滑肌细胞会迁移到移植物内 选文原因 剪切力方法的设计是一个新思路 选取了几种有代表性的细胞表面因子进行考察，方法全面，实验设计严谨，效果明显 不足：没有对讨论中涉及的其他材料进行平行实验进行对照，没有解释为什么激活的整合素β在剪切力处理后降低 A prototype tissue engineered blood vessel using amniotic membrane as scaffold 何 孟 2012年12月6号 1 研究简介 2 实验材料和方法 实验结果 讨论与结论 3 4 目 录 基于薄片的TEBV 天然支架TEBV 1986年开始使用 利用活体血管细胞和天然基质分子 已有多例报道 存在力学性能问题 包含活的纤维母细胞和组织良好的基质天然蛋白 收获和种植细胞花费时间，限制应用 1.1方法比较 一 . 研究简介 1.2 选材及原因 AM（羊膜） 单层上皮细胞 无血管基质 基底膜 ⅳ和ⅶ型胶原 纤连蛋白 层纤连蛋白1,5 去表皮化的AM无免疫源性，且它在眼部手术，表面移植的通畅性，已经在临床上得到验证 对于促进上皮细胞粘连有重要作用 以AM为基质的培养的EC相应的表达更多的血管内钙连蛋白和整合素 种植在AM上的内皮细胞（EC）的选择素E和选择素P的表达降低（相对于在培养皿培养），相应的其对于白血球的黏附也相应减少 AM（羊膜） 证明戊二醛交联的AM.可以缩短TEBV的合成时间 并能解决内皮细胞对于TEBV的黏附问题 将AM做成管状 用戊二醛交联 用猪血管内皮 对材料进行内皮化 在一定时间和生物条件下 通过不同剪切力处理 对细胞黏附进行表征 戊二醛交联 内皮化 剪切力 影响 1.3 实验思路 二 .方法和材料 2.胰蛋白酶消化，刮去EC 1.PBS无菌洗涤 4.绕在聚四氟乙烯棒上 3.无菌水冲洗，切块 6.甘氨酸中和 5.戊二醛交联 8.4℃无菌保存 7.双蒸水冲洗 交联AM管 AM棒 去上皮的AM 人的AM AM的获取 2.1 AM的准备 和支架制备 2.2 细胞培养 猪动脉上皮细胞的提取（步骤同前） 甘氨酸处理后，低速离心获得细胞 M199重悬后传代培养（1:3传代） 取P2，P3代细胞进行实验 4 1 2 3 2.3 TEBV的剪切力测试 1 交联的AM管内壁种植EC 密度：2×105cm-2 2 培养两天，TEBV上形成单层细胞，然后放入进行生物反应器测试（测试时间均为四天） TEBV 流速控制 培养液 存储器 微型搏动泵 生物反应器构成 剪切力计算公式 τ：剪切力（达因每平方厘米） 1 达因 = 10-5牛 η：培养液粘稠度 d : TEBV的内壁直径 Q :流速（立方厘米每秒） 通过流速控制剪切力大小 测试及检验方法 实验组 通过控制流速使剪切力在0.5-12达因的范围 培养2-4天，进行免疫学和组织学检测 对照组 在静止状态下，采用相同条件进行培养 培养时间相同，进行相同检测 检验 AM管内细胞通过核染色进行计数 随机抽取三个区域进行荧光显微计数并拍照 2.4 免疫荧光染色 肌动蛋白 用 Alexa Fluor-phalloidin 染色 PECAM-1(血小板内皮细胞黏附因子-1)，用小鼠抗大鼠CD31抗体结合， 再用与 与荧光蛋白结合的山羊抗小鼠IgG蛋白染色 VE-钙粘蛋白：用大鼠抗猪的CD144抗体结合，再用 德州红共轭的山羊 抗小鼠IgG蛋白染色 整合素β1：小鼠抗猪整合素β1的抗体结合，再用荧光蛋白结合的山羊 抗小鼠蛋白染色 细胞核：碘化丙啶染色 共聚焦显微镜和荧光显微镜观察 2.5 蛋白印迹分析 EC细胞蛋白的SDS电泳 转移到PVDF膜 脱脂牛奶封闭 小鼠抗大鼠PECAM-1抗体标记 PECAM-1 小鼠抗猪VE-钙粘蛋白标记 VE-钙粘蛋白 HRP（辣根过氧化物酶）结合的IgG二抗标记 显色分析 2.6 统计学分析 t分布检验 选取显著值P0.05 标准误的方法表示结果（SEM） 三 .实验结果 3.1 剪切力的影响 内皮化 剪切力 处理 观察 结果 取制备好的 AM管 用猪的内皮 细胞进行内皮化 培养两天 实验组用