第四章核酸的化学2赵紫华.pptVIP

第四章 核酸的化学 第三节 核酸理化性质及纯度测定 噬菌体T2的DNA分子量约为1X108 大肠杆菌染色体DNA分子量约为2X109 果蝇染色体DNA分子量约为8X1010 RNA分子比DNA分子小得多，约为（2.3~110)X104 核酸微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂，通常用乙醇沉淀出核酸。钠盐更容易溶于水。 在水中溶解度：核酸核苷0酸碱基 天然DNA分子粘度极大，RNA粘度比DNA小。 粘度作为DNA变性指标 两性电解质，生理状态下呈酸性，为多价阴离子。 碱基之间的氢键性质与其解离状态有关 DNA等电点为4～4.5； RNA等电点为2～2.5 四、核酸的紫外吸收 由于核酸的组成成份嘌呤和嘧啶碱存在共轭双键，所以核酸在260nm处有最大紫外吸收。 核苷酸单链双链 通过其光吸收对DNA和RNA进行定量和定性测定 五、核酸的变性和复性（denaturation renaturation） 核酸的变性（denaturation）：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 DNA的溶解温度（熔点）（melting temperature） 变性过程是“跃变式”的，而非渐变。通常把将紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度值称为“熔点”或溶解温度，用Tm表示。 Tm值与G、C的含量成正比，经验公式（G+C）%＝(Tm－69.3)×2.44 一般DNA的Tm值在70-85℃之间 五、核酸的复性（renaturation） 变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的互补链全部或部分回复到天然双螺旋结构的现象，称为复性(renaturation)。它是变性的一种逆转过程。 复性后DNA理化性质得到恢复，例如e(p)值降低（减色效应）、粘度降低和生物活性部分恢复等。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 五、核酸的杂交(hybridization) 在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链与RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称为核酸的杂交。 杂交程度与同源性成正比。 所依据的原理是：碱基互补 五、核酸的杂交(hybridization) 步骤： 破碎细胞 去蛋白 沉淀核酸 乙醇漂洗 风干样品并溶解 DNA蛋白（DNP）中除去蛋白的方法 去除蛋白： 苯酚提取：新蒸馏苯酚与DNA蛋白（DNP)振荡冷冻离心，反复多次后合并水层（含DNA)，加入2.5倍冷无水乙醇将DNA沉淀出来。 三氯甲烷-戊醇提取： DNP溶液与三氯甲烷-戊醇（3：1）剧烈振荡离心，上层为DAN、水、蛋白质，下层三氯甲烷和戊醇，中间层为蛋白质凝胶，上层水相反复用三氯甲烷-戊醇处理至没有蛋白质凝胶出现为止。 去污剂法：十二烷基硫酸钠 酶法：用广谱蛋白酶使蛋白质水解。 溶于在10%NaCl溶液，加热90℃，离心出去不溶物，加入乙醇使RNA沉淀 盐酸胍（2mol/L)溶解大部分蛋白质，冷却，RNA析出，再用三氯甲烷出去少量的残余蛋白质。 去污剂法：十二烷基硫酸钠 苯酚法：用90%苯酚提取，离心，蛋白质和DNA留在酚层，RNA留在水层，分离。 DNA分离纯化过程中需要加入抑制DNA酶的作用物质：柠檬酸钠 RNA 酶抑制剂：皂土 (二)核酸含量的测定 一 填空 1 细胞内的RNA 有三种，都是rRNA, tRNA 、mRNA 。其中含量最丰富的是_ rRNA,种类最多的是_ mRNA 2 tRNA的二级结构呈三叶草形，三级结构呈倒L形，其3′末端有一共同存在的碱基序列CCA，其功能是携带活化了的氨基酸 3 核酸的基本结构单位是核苷酸， 4 核酸分为DNA和RNA 两类，构成两者的戊糖分别为 脱氧核糖和核糖，两者特有的碱基分别为T和U ，两者主要存在的部位为细胞核和胞液 5tRNA的二级结构分为氨基酸接受臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环、TψCG 环 3 原核细胞mRNA结构特点： 多为顺反子结构，即一个单链mRNA分子可作为多种多肽和蛋白肽链合成的模板 转录与翻译是耦合， mRNA分子一边转录一边翻译 包含有先导区、翻译区、非翻译区，即在两个顺反子之间有不参与翻译的插入顺序 4真核细胞mRNA结构特点： 真核mRNA的3′末端有200个多聚腺苷酸 (polyA)尾巴，它与 mRNA从细胞核移至细胞质过程有关，也与mRNA半衰期有关。 真核mRNA的5′末端含有7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸（帽子结构） 真核 mRNA一般为单顺反子，及一个mRNA分子只能为一种多肽编码 转录和翻译分开进行，先在核内转录产生前体mRNA，转运到细胞质内后，再在核外加工成熟mRNA。 变性、退火、延伸三步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。 5’