高变区1抑制丙型肝炎病毒包膜E2蛋白免疫原性的机制分析-微生物学专业论文.docxVIP

高变 高变区 1 抑制丙型肝炎病毒包膜 E2 蛋白免疫原性的机制研究 第二军 第二军医大学硕士学位论文 - - PAGE 1 - - - PAGE 2 - 摘 要 丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV) 为单股正链 RNA 病毒，黄病毒科成员，是 经血液传播而引起急、慢性肝炎的主要致病因子之一。目前全球约有 1.7 亿人感染 HCV， 每年新发感染者约 300 万例。HCV 慢性感染率高达 70%以上，HCV 慢性感染在发达国 家是导致肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病的主要原因。HCV 感染还与多种肝外疾病， 如淋巴瘤、混合性冷球蛋白血症、肾小球肾炎、迟发性皮肤卟啉症、糖尿病等密切相关。 目前全球范围内经血液以及血制品途径感染的丙型肝炎病例与上世纪九十年代以 前相比有大幅下降，但在发展中国家血液和血制品仍然是传播 HCV 的重要途径。此外， 每年散发性以及传播途径不明的丙型肝炎新发病例在全球范围内仍高居不下。控制 HCV 感染的关键措施还依赖于开发出有效的疫苗。从 1989 年 HCV 基因组被克隆以来，丙型 肝炎疫苗的研究在欧美和日本等发达国家一直是研究热点，但迄今未有有效的疫苗问 世。 HCV 包膜 E2 蛋白是介导 HCV 细胞侵入的关键蛋白，该蛋白氨基末端的 27 个氨基 酸 是 第 一 个 鉴 定 出 的 含 中 和 抗 体 表 位 的 区 域 ， 因 其 序 列 高 变 而 被 称 为 高 变 区 1 （hypervariable Region 1，HVR1），HVRl 的高度变异曾被认为是遏制丙肝疫苗发展的 瓶颈问题。然而，近几年来基于感染性假 HCV 颗粒（HCVpp）以及细胞培养产生的 HCV（HCVcc）的中和试验表明，HVRl 并不是唯一的中和抗体表位所在区域，在 HCV 包膜 E2 蛋白中还存在保守的空间构象和线性中和抗体表位。 本实验室之前研究 HVR1 免疫特性时发现：HVR1 具有强免疫原性，可高效诱导中 和抗体，同时，HVR1 非常显著地抑制 HCV 包膜 E2 蛋白中保守抗原表位的抗体应答。 本研究中，我们进一步从免疫原性和蛋白结构等方面分析 HVR1 免疫诱饵作用的可 能机制，并鉴定出其中的关键氨基酸序列，为认识 HCV 免疫逃避以及 HCV 细胞侵入 机制提供全新信息，为 HCV 疫苗的研究提出全新思路。 一、HVR1 中抑制 E2 蛋白免疫原性的关键肽段的鉴定 方法：1、质粒构建：以 1a 基因型 H77 株 HCV 包膜蛋白基因为原型，构建 HVR1 中部分氨基酸残基缺失的各种分泌型 E2 蛋白表达质粒，包括缺失整个 HVR1（77Δ）、 缺失 HVR1 第 1 至 12 位氨基酸残基（77Δ1-12）、缺失第 13 至 27 位氨基酸残基 （77Δ13-27）、缺失第 16 至 24 位氨基酸残基（77Δ16-24）以及含完整 HVR1（77）的 5 种质粒。2、E2 蛋白表达检测：用 ELISA、Western blot 和免疫荧光检测各种 E2 蛋白的 表达和分泌。3、DNA 免疫：将上述质粒肌肉注射免疫 Balb/C 小鼠。4、抗体检测：用 ELISA 和免疫荧光检测小鼠血清中的 E2Δ 抗体、HVR1 抗体以及三个已知 B 细胞表位 （412、522、432）的反应。 结果：缺失 HVR1 或其中的部分残基对 E2 蛋白的表达、分泌及构象无明显影响。 含有 HVR1 或 HVR1 第 16-24 位氨基酸的质粒可免疫小鼠诱导产生 HVR1 抗体，同时 抑制 E2 蛋白中其他表位的抗体应答，而去除第 16-24 位氨基酸即可消除这种抑制作用。 结论：高变区 1 中的 16-24 位氨基酸为抑制 E2 蛋白免疫原性的关键肽段，而该肽 段是我们前期鉴定出的 H77 株 HVR1 中的唯一 B 细胞表位。 二、HVR1 抑制 HCV 包膜 E2 蛋白免疫原性的机制研究 方法：1、构建质粒：将 HVR1 移位到 E2 蛋白羧基末端（77Δ-HC）、在 E2 羧基末 端增加 HVR1 肽段（77-HC）；将 HVR1 与 HBsAg 串联（S-HN）；将 HVR1 替换为其他 抗原表位 HA 表位（77HA）。2、将各重组质粒免疫小鼠。3、检测小鼠产生的 HVR1 抗 体、HA 抗体、E2 抗体以及 HBsAg 抗体，分析各种抗体水平之间的相关性。 结果：1、HVR1 的定位不影响其对 E2 免疫原性的抑制作用。2、HVR1 可抑制 HBsAg 诱导的抗体应答。3、HA 表位也能抑制 E2 的免疫原性。 结论： HVR1 是免疫优势表位，可抑制 HBsAg 的免疫原性；E2 蛋白其他区域的免 疫原性易受 HVR1 以及 HA 表位的影响，导致诱导抗体的能力