高毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ab基因的克隆-农业昆虫与害虫防治专业论文.docxVIP

摘要 苏云金芽孢杆菌(Bacillus lhuringiensis)是目前防效显著、应用广泛的微生物 杀虫剂。深入发掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源，筛选高毒力及特异性菌株．分 离克隆新型商毒力的杀虫蛋白基因，对微生物杀虫剂的研制、构建高效广谱工程微 生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论及实践意义。 本研究从河北省境内44个县市采集土样500份，从中分离出苏云金芽孢杆菌 25株。生物测定结果表明：WZ-2，WZ-7，WZ．4，WZ．5对多种鳞翅目害虫幼虫具 有高毒力，如小菜蛾、菜青虫、棉铃虫、玉米螟、甜菜夜蛾。特别是WZ．7菌株， 对棉铃虫(胁licoverpaarmigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫，LC50分别为3 30×10’cells／mL、l 16×105cells／mL、5．2l× 106cells／mL；WZ．9对马铃薯瓢虫有特效，LC50为2．95×107cells／mL 利用PCR-RFLP鉴定体系对WZ-7菌株进行基因型分析，鉴定结果显示该菌株 含有crylAb、crylCa、crylBa、cry2Ab、cryllal基因，并且这5种基因型全部定位 于质粒上。 根据已知的cry2Ab基因ORF序列，设计合成了一对特异性引物，PCR扩增出 cry2A6基因全长，并直接与pUCm-T载体相连。将其连接产物转化大肠杆菌菌株 DH5 a．PCR-RFLP鉴定克隆转化子，得到阳性克隆pWZ2Ab。核酸序列分析及氨 基酸同源性比较．该基因与已知的cry2Abl、cry2Ab2、cry2Ab3、cry2Ab4基因的 同源性分别是99．80／0、99．8％、99 8％和99 5％，其编码的氨基酸在位点l 10、414、 446、497、514与已知的4种Cry2Ab毒素蛋白发生了变化。该基因编码区为1902bps， 编码633个氨基酸的晶体蛋白，分子量为70 6kDa，等电点为p18 96．属于弱碱性 蛋白。该基因序列目前已在向GeneBank登记注册，AccessionNumber为AY297091t 并已提交国际Bt．6．内毒素基因命名委员会命名。 关键词：苏云金芽孢杆菌，cry基因，杀虫活性，PCR-RFLP，基因克隆  独创性声明 本人声明所提交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得煎韭魁}馘其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所作的任何贡献均已在论文 中作了明确地说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 帚永 签字日期：如≥年苦月抄日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西±生蝎渔琏有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权固丑墟h△坠可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：予扛 导师签名；砂锄炙 签字日期：a·d年f月卸日 签字日期：》·弓年6月跏目  河北农业大学硕士学位毕业论文 文献综述 1．苏云金杆菌的生物学特征、分类、分布 1．1苏云金杆菌的形态特征 苏云金杆菌为革兰氏阳性细菌，其营养体细胞为杆状、两端钝圆，外壁肽聚糖 含量丰富。大小为1．2～1．81tm×3．0～5．0p,m，周生鞭毛或无鞭毛，营养体多个相连成 长链状。孢子囊膨大或不膨大，比营养体粗壮，在孢子囊内除芽孢外，在另一端还 有伴孢晶体，孢子囊在后期破裂，释放出游离的伴孢晶体和芽孢。芽孢亦称孢子， 卵圆形，有光泽。大小为0_8~0．9“mx21am，芽孢是休眠阶段．对高温、干燥等恶 劣环境条件有较强的抵抗能力：伴孢晶体简称晶体，形状因亚种不同而异，多为菱 形、方形，但也有呈立方形、球形、不规则形Il_’j，41 Bt菌落在不同培养基上形态有所差异，在营养琼脂平板上一般呈圆盘状，乳白 色，表面干燥，平坦，边缘不整齐，呈粗布状向外散开，略带放射状皱纹。 1．2苏云金杆菌的分类 自1901年首次披分离出来，苏云金杆菌的分离地位一直存在许多争论，其主 要原因在于该菌与其近缘种一蜡状芽孢杆菌(Bacillus ceteus)在形态学及生理生化 特征上的广泛相似性，二者的主要区别仅限于苏云金杆菌在形成芽孢的同时，还形 成对昆虫有毒性的伴孢晶体。虽然在分类学上同蜡状芽孢杆菌非常相似，但从实际 意义和实际应用出发，微生物分类学家和应用微生物学家却始终保留苏云金杆菌在 芽孢杆菌属中作为独立种的分类地位。197