AGEsRAGE轴通过P3MAPKJNK信号通路促进人主动脉平滑肌细胞凋亡.docxVIP

四纠匡型太堂亟土堂僮途塞目 四纠匡型太堂亟土堂僮途塞 目 录 l AGEs／RAGE轴通过p38 MAPK／JNK信号通路促进人主动脉平滑 肌细胞凋亡 O Dlll 1 1．1 中文摘要 1 1．2 英文摘要 4 1,3 前言 8 1．4 材料与方法 01 0 12 1．5 结果 22 1．7 结论 44 1．8 参考文献 45 1．9 英汉缩略词对照表 52 2 致谢 53 3 AGEs／RAGE轴在促进血管细胞凋亡在血管钙化中的作用及机 制的研究进展(综述) 54 万方数据 四川医科大学硕士学位论文AGEs／RAGE轴通过p38 四川医科大学硕士学位论文 AGEs／RAGE轴通过p38 MAPK／INK信号通路促进 人主动脉平滑肌细胞凋亡 摘 要 目的：血管平滑肌细胞的凋亡在血管钙化中的作用受到越来越多的重视。 研究表明，在动脉粥样硬化斑块中凋亡的血管平滑肌细胞明显增多；在 慢性肾病患者体内由于钙磷代谢紊乱，产生的大量磷酸钙晶体被血管平 滑肌细胞吞噬，再通过细胞溶酶体作用而被降解，引起细胞内钙、磷水 平急剧升高，导致细胞凋亡，继而形成凋亡小体，这些凋亡小体可作为 血管基质矿化的核点启动钙化过程。晚期糖基化终末产物(advanced gly cation end products，AGEs)是一组由体内糖的醛基与蛋白质的氨基相 互作用生成的一种带电荷的氨基酸残基，生理状态下机体内AGEs表达很 低。生物体内AGEs通过与相应受体相结合后发挥生物学作用，目前研究 最多的受体为RAGE(receptor for advanced glycation end product s)。本研究拟探究AGEs在入主动脉平滑肌细胞(HASMCs)凋亡中的作 用、是否通过AGEs-RAGE(配体一受体结合方式)来发挥生物学效应以及 相关信号通路的分子机制。 方法：原代培养入主动脉平滑肌细胞，取第3-5代细胞进行试验。用不 同浓度AGEs—BSA(50mg／L、lOOmg／L、200mg／L)刺激细胞48h后，流式 细胞仪检测HASMCs的凋亡，Western blot检测细胞中促凋亡相关蛋白p 53、BAX、Caspase3，抗凋亡相关蛋白p65、Cox一2、Bcl2以及RAGE蛋白 表达情况。为确定RAGE在AGEs促细胞凋亡中的作用，分别构建人过表 达和沉默RAGE基因的慢病毒载体，分别将其转染至HASMCs，Western b 万方数据 lot和q-PCR检测成功达到不同RAGE蛋白表达效率的HASMCs后，予以A lot和q-PCR检测成功达到不同RAGE蛋白表达效率的HASMCs后，予以A GEs—BSA刺激，流式细胞仪检测表达不同水平RAGE蛋白的HASMCs的凋亡， Western blot检测相应细胞中促凋亡相关蛋白p53、BAX、Caspase3，抗 凋亡相关蛋白p65、Cox一2、Bcl2的表达情况。为明确p38 MAPK、7NK 途径是否参与细胞凋亡过程，给予AGEs-BSA刺激细胞不同时间(6h、12 h、24h、48h)后，Western blot检测HASMCs的JNK和p38 MAPK磷酸 化产物的活化情况；为继续验证p38 MAPK、JNK途径的作用，分别弓l入 iNK抑制剂sp600125和p38 MAPK抑制剂SB203580干预细胞，再次运用 流式细胞仪检测HASMCs的凋亡，Western blot检测细胞caspase3蛋白 表达情况。 结果：成功培养人主动脉平滑肌细胞，分别予以不同浓度(50mg／L、lOOmg／L、 200mg／L)AGEs～BSA刺激48h后，细胞凋亡呈浓度依赖性增加，凋亡率分 别为8．43％、12．49％、24．90％；HASMC中促凋亡相关蛋白p53、BAX、Caspase3 表达呈浓度依赖性增加，抗凋亡相关蛋白p65、Cox一2、Bcl2表达呈浓度依 赖性降低；HASMCs中RAGE蛋白表达呈浓度依赖性增加。构建过表达／沉默 RAGE基因的HASMCs稳定细胞株，各株细胞绿荧光蛋白成功表达；RAGE基 因过表达细胞中RAGE蛋白表达水平明显高于对照组(0。97±0．02vsO．44 ±0．01，pO．01)；RAGE基因过表达细胞中RAGE mRNA水平明显高于对照 组(1588．55vsl．26)：RAGE基因沉默细胞中(RAGE-shRNA一3沉默细胞后 细胞活性明显受到抑制，在转染24h内基本死亡)RAGE蛋白表达水平咀显 低于对照组(0．56±O．02，0．86±0．Olvsl．25±0．02，pO．01)；RAGE基 因沉默细胞中RAGE mRNA水平较对照组受到显著干扰，RAGE—shRNA一2组干 扰率为99．55％：RAGE—shRNA