ezrin相关蛋白网络在人精子获能过程中的功能研究组织胚胎学专业毕业论文.docx

南京医科大学博士学位论文中文摘要 南京医科大学博士学位论文 中文摘要 受精是一个新个体产生的标志，是指精子和卵子自发融合成为 受精卵的过程，要完成这一过程必须具备一定的条件，精子获能就 是其中之一。获能是指精子获得使卵细胞受精的能力，是精子在自 然状态下完成受精过程的一个必需条件。哺乳动物的精子在受精前 都要经历获能过程。在精子获能过程中，对于精子质膜的修饰改变 是这一过程的一个关键事件。但是迄今为止，对于这一重要事件分 子机制的研究结果还不多，远不能阐明这一过程。 Ezrin蛋白是ERM蛋白家族的成员之一，也是该家族中被研究 最多的蛋白。在体细胞中的大量研究显示，ezrin是细胞皮质骨架蛋 白与细胞质膜固有膜蛋白之间的衔接蛋白，它的主要作用是通过对 骨架蛋白与膜蛋白的衔接作用，引起细胞膜表面结构的重构，从而 介导包括细胞黏附、变形、微绒毛形成等一系列的细胞事件。不仅 如此，活化的ezrin还能够和Rho解离抑制因子卅hoGDI一起促 进细胞表层骨架蛋白的形成，从而使actin聚合形成F—actin。因此， 在体细胞中就存在一个由ezrin、actin、RhoGDI、Rho蛋白以及质膜 蛋白共同形成的蛋白网络体系。这个蛋白网络的主要作用就是对细 胞膜的表面结构进行组装。 本实验室在前期研究工作中发现，ezfin和RhoGDll表达于人睾 丸组织中，那么，会不会前述与ezrin相关的蛋白网络体系也能在精 子中发挥功能呢?因为在精子获能过程中也存在膜重构的现象。我 南京医科大学博士学位论文们推测，这个网络体系可能作用于精子获能过程中的膜重构。针对 南京医科大学博士学位论文 们推测，这个网络体系可能作用于精子获能过程中的膜重构。针对 这一问题开展了以下研究：(1)用ERM家族磷酸化位点的抗体行不 同获能状态精子蛋白的Western Blot实验，结果显示在精子获能过程 中，ezrin第567位苏氨酸发生了磷酸化修饰，这说明ezrin在获能过 程中被活化。推测活化后的ezrin可以与下游一系列蛋白通过直接或 间接相互作用参与膜的重构，故运用一系列免疫共沉淀试验进行验 证。(2)用免疫共沉淀方法比较获能前后ezrin与RhoGDll相互作用 情况，结果显示，两者的相互作用在获能后增加；运用二维电泳结 合银染和磷酸化染色方法，结果显示，RhoGDll自身还在获能过程 中发生了磷酸化修饰，前述两个结果均可导致RhoGDll自Rho蛋白 解离下来。对后者用免疫共沉淀的方法进行验证，结果符合预想， RhoGDll与RhoA的相互作用在获能后减弱。这一结果提示RhoA 可参与下游一系列通路导致F-actin形成。(3)对于这一系列事件的 最终结果用F—actin特异性染料Texas Red．Phalloidin染色进行分析， 结果显示，获能后，精子的F．actin染色尤其是头部的染色明显增强。 说明获能过程中actin聚合。(4)据体细胞中的研究，ezrin可以和 F—actin相互作用，故运用Co．IP方法对ezrin和F．actin的相互作用 进行分析，结果显示获能后ezrin与F．actin的相互作用增强。这与 体细胞中的现象类似，因此我们推测ezrin还可通过其氨基端与膜相 互作用。(5)筛选了一个精子膜蛋白cd44，同样运用免疫共沉淀的 方法比较其与ezrin相互作用情况，结果显示，ezrin在获能后与cd44 相互作用增加，且ezrin不仅可以和ed44的未修饰形式相互作用， 南京医科大学博士学位论文还可与其糖基化修饰形式相互作用。(6)最后，分析egin和actin在 南京医科大学博士学位论文 还可与其糖基化修饰形式相互作用。(6)最后，分析egin和actin在 获能中可能的功能，分别用e可iIl和actin抗体对获能和顶体反应进 行阻断，结果显示，ezrin和actin抗体能够阻断精子获能但对于顶体 反应则没有影响。 总之，本研究为人精子获能分子机制提出了一个新的假说，即 在人精子获能过程中，emn、RhoGDll、actin、I让oA及膜蛋白可以 通过相互作用形成一个蛋白网络体系，这样的网络可以调节获能过 程中精子质膜重组、精子膜蛋白的重新分布，从而促进精子与卵子 的受精过程。 关键词：e面n蛋白网络获能膜重构 南京医科大学博士学位论文英文摘要 南京医科大学博士学位论文 英文摘要 Before fertilization，sperm must fulfill some preparative events that render the spermatozoa competent for fertilization，which collectively known as capacitation．Capacitation is