etec k88abk88ad毛操纵子fae全基因的克隆 表达及lt提升细菌黏附性能的初步分析.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 lIill 1 1 1 III III III I IIII l UI ． 郁磊：ETEC K88ab／K88ad菌毛操纵子fae全基冈 Y2049842 1 LT提升细菌黏附性能的初步研究 ETEC K88ab／K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表 达及LT提升细菌黏附性能的初步研究 专业：微生物学 研究生：郁磊 导师：朱国强教授 中文摘要 产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coil ETEC)是导致断奶前仔猪 腹泻和死亡的主要病原之一。该病原菌含有两种致病因子：菌毛粘附素和肠毒素。 菌毛粘附素与上皮细胞微绒毛的相互作用使ETEC能定殖于仔猪小肠。首次从腹 泻仔猪分离鉴定的ETEC菌毛粘附素为K88菌毛。大多数从腹泻仔猪分离到的 ETEC菌株表达有K88、K99、987P或F41菌毛粘附素；其中，K88是最流行的 菌毛枯附素。近期的研究认为，细菌表达热敏肠毒素LT的功能除了导致宿主腹泻 外，对小肠上皮细胞的细菌黏附具有促进作用。因此，本研究将集中如下???部分： 一、克隆、表达ETEC K88ab／K88ad菌毛基因，并比较K88菌毛三种血清型的野 生菌和重组菌对猪小肠上皮细胞的黏附差异；二、克隆、表达LT毒素基因，并探 索LT毒素的表达对小肠上皮细胞的细菌黏附性能的影响。上述研究旨在为深入全 面地研究ETEC的毒力因子奠定基础。试验分如下两部分： 研究一：利用PCR技术，以产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88ab标准株C83901 和K88ad标准株C83903基因组DNA为模板扩增出编码K88菌毛操纵子fae基因， 大小约7．9Kb。将其克隆入表达质粒载体pBR322，经限制性内切酶消化、琼脂糖 电泳鉴定，构建和筛选出含J下确插入fae操纵子基因的pBR—K88ab和pBR．K88ad 重组质粒。进一步将上述重组质粒DNA转化入不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000 株。该重组菌可分别和鼠抗重组k88菌毛多抗血清和鼠抗K88菌毛单克隆抗体产 生凝集反应，在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88菌毛。用热抽提法提取其 体外表达的K88ab和K88ad菌毛，经SDS．PAGE电泳和考马斯亮蓝染色主要结 构单位菌毛呈单一分子量约为26KDa蛋白条带。玻板凝集试验和Western blot结  扬州人学硕Ij学位论文 果表明：体外表达的K88ab、K88ad菌毛和野生型K88菌毛具有同样的免疫原性 和反应原性。以猪小肠上皮细胞系IPEC．J2为模型进行黏附试验和粘附抑制试验， 结果表明：表达K88菌毛三种血清型的野生型标准株和重组菌株均能很好的黏附 于IPEC．J2上皮细胞，而且鼠抗重组K88菌毛血清能有效抑制上述重组菌或野生 菌株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。 研究二：利用PCR技术，以K88ac标准株C83902基因组DNA为模板扩增出 热敏肠毒素LT基因，大小约1．1Kb。将其克隆入表达质粒载体pACYCl84．经限 制性内切酶消化、琼脂糖电泳鉴定，构建和筛选出含正确插入LT基因的 pACYC．LT重组质粒。利用类似的方法，构建和筛选出两种含点突变LT基因的 重组质粒(pACYC．LT72和pACYC．LTl92)。进一步将上述重组质粒DNA转化 入不表达任何毒素的大肠杆菌SE5000株。GMI．ELISA结果表明，上述重组菌均 能在体外正常表达LT毒素蛋白。以猪小肠上皮细胞系IPEC—J2为模型，比较了 表达和不表达LT基因的细菌对细胞的黏附性能。试验数据表明，LT的表达使细 菌对肠上皮细胞的黏附效应明显增加(12．34-3．4倍)。LT毒素蛋白的两个单氨基 酸突变体的表达，证明了LT毒素的ADP核糖基化作用对其增强致病菌对肠细胞 的黏附作用是必要的。蛋白激酶A的抑制剂Rp．cAMP、腺苷酸环化酶的抑制剂 DDA和LT毒素的受体GMl都可阻断LT毒素对细菌黏附性能的提升作用。 关键词：产肠毒素大肠杆菌；K88菌毛；热敏肠毒素；黏附；IPEC．J2  郁磊：ETEC K88ab／K88ad菌毛操纵子fae全基冈的克隆、表达及 LT提升细菌黏附性能的仞步研究 Cloning and Expression of K88ab／K88ada K88ad Fimbrim brial Operon Gene Clusters from Enterotoxig’enic Escherichia coil and Confirmation of LT，ability to promote ETEC Adherence to IPEC--J2 M．S．Candidate：Lei Yu Supervisor：Pro￡Guoqiang Zhu Abstrac