erk12信号通路调控糖尿病视网膜muller细胞分管内皮生长因子的作用研究.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 复旦大学博士论文 复旦大学博士论文 中文摘要 ERKl／2信号通路调控糖尿病视网膜Muller细胞分泌 血管内皮生长因子的作用研究 中文摘要 第一部分：糖尿病大鼠视网膜氧化应激、EIⅨ1／2信号通路激活 以及VEGF分泌的研究 目的：研究1)糖尿病大鼠模型早期视网膜是否出现氧化应激；2)糖尿病大鼠 模型早期视网膜氧化应激是否激活了ERKl／2信号转导通路；3)糖尿病视网膜 ERKl／2信号转导通路的激活与视网膜VEGF分泌的相关性；5)ERKl／2激活在 视网膜Muller细胞上的表达。 方法：腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型，取不同时间点：7天(d)、14天(d)、 21天(d)、1月(m)、2月(m)和3月(m)进行各项实验。化学比色法检测 氧化应激损伤相关指标，包括超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH) 浓度、丙二醛(MDA)浓度，电镜观察不同类型细胞(神经节细胞、Muller细 胞、血管内皮细胞、周细胞、色素上皮细胞)线粒体的超微结构。Western-blot 研究ERKl／2信号通路磷酸化激活的变化趋势。免疫组织化学的方法观察磷酸化 激活的ERKl／2在视网膜中表达的部位。通过EMSA方法研究ERKl／2下游底物 AP．1核转录因子激活的变化趋势。Real．time PCR以及Western-blot研究 VEGFmRNA和蛋白表达量的变化趋势。为了观察氧化应激对ERKl／2信号通路 的激活作用，给予药物Tocopherol干预氧化应激，Western-blot方法观察对视网 膜ERKl／2磷酸化蛋白表达影响。 结果：氧化应激相关检查显示在糖尿病7d时视网膜就出现氧化应激损伤，表现 为SOD活性下降、GSH浓度下降、MDA浓度升高。糖尿病2m时表现出更显 著的损伤指标(PO．05)。电镜观察细胞线粒体，DM7d，Muller细胞及神经节细 胞线粒体出现结构异常。Western-blot结果，DM7d时ERKl／2信号通路激活，至 2m时达到高峰，期间有上下波动波动。EMSA结果显示糖尿病成模后AP．1DNA 结合活性升高，并且波动趋势相似于磷酸化的ERKl／2。VEGF结果显示蛋白及 mRNA表达量均升高，波动趋势相似于磷酸化ERKl／2及AP．1。通过干预氧化 应激，ERKl／2磷酸化蛋白表达量下降。免疫组化结果显示DM7d视网膜内核层 出现磷酸化ERKl／2的阳性颗粒，并且在DM2m时表达更为增加。 讨论：1)在糖尿病模型极早期视网膜出现了氧化应激损伤，并且神经细胞的损 伤早于血管细胞。2)在糖尿病模型极早期视网膜ERKl／2信号通路激活，VEGF 蛋白量及mRNA表达升高，两者间波动趋势相似。ERKl／2下游核转录因子AP．1 复旦大学博士论文 复旦大学博士论文 中文摘要 的波动也表现出类似趋势。3)干预氧化应激能抑制ERKl／2磷酸化激活，提示 糖尿病环境下氧化应激可以激活ERKl／2信号通路。4)视网膜Muller细胞可能 存在ERKI／2信号通路的激活。 第二部分高糖刺激Muller细胞对氧化应激、ERKl／2信号通路 及ⅦGF的分泌影响研究 目的：研究1)体外培养的Muller细胞在高糖环境下氧化应激损伤；2)高糖环 境下Muller细胞是否出现ERKl／2信号通路的激活；3)高糖环境下Muller细胞 核转录因子AP．1是否激活；4)高糖环境下Muller细胞VEGF分泌的变化。 方法：取新生大鼠视网膜Muller细胞纯化培养。传代后2．3代细胞，高糖(30mM) 刺激不同时间：8h、12h、24h、36h、48h，流式细胞仪观察ROS生成，激光共 聚焦显微镜观察线粒体膜电位的下降，电镜观察线粒体超微结构。Western-blot 方法观察高糖刺激24h后ERKl／2磷酸化激活的表达量，细胞免疫荧光观察 ERKl／2磷酸化激活的表达。EMSA方法观察高糖刺激24h后AP．1 DNA探针结 合活性。Real．time PCR检测AP．1的主要组成元件c．Fos和c．Jun mRNA表达量。 Real．time PCR检测高糖刺激8h、12h、24h、36h、48hVEGF mRNA表达量，ELISA 检测高糖刺激8h、12h、2411、36h、48h培液中VEGF浓度。 结果：随高糖刺激时间的不断延长细胞内ROS逐渐升高，在24h骤升(PO．05)。 高糖刺激24h后细胞线粒体膜电位下降，并且电镜下线粒体超微结构发生异常改 变。高糖刺激24h后ERKI／2磷酸化蛋白量增加，并且磷酸化ERKl／2表达于细 胞核内。高糖刺激24h后Muller细胞内AP．1 DNA结合活性升高，Real-time显 示c．Fos和e-Jun mRNA表达量也升高(P0．05