GB/T 18641-2002伪狂犬病诊断技术.pdf

GB1T 18641-2002 前 言 伪狂犬病(pseudorabies,YR;Aujeszkysdisease,AD)是危害猪、牛、羊、狗、猫、家兔等多种家畜和 野生动物的一种急性传染病。除猪以外的动物感染伪狂犬病病毒后，主要是以发热、奇痒和脑脊髓炎症 状为特征.以死亡为结局，并呈散发形式。本病对养猪业危害最大，猪感染后可引起妊娠母猪流产、产死 胎和木乃伊胎;仔猪大量死亡，15日龄内死亡率为100%,断奶仔猪死亡率 10%-20%，种猪不育，母猪 返情，空怀，公猪翠丸发炎肿胀、萎缩、失去种用能力;育肥猪增重缓慢、饲料报酬降低。本病呈世界性分 布。 本标准规定的病原学诊断方法主要用于死亡动物的病料检测和活体动物的鼻拭子样品检测，其中 聚合酶链反应具有快速、灵敏的特点，可用于大批样品的检测。血清学诊断主要用于非免疫动物的诊断、 血清流行病学调查和免疫动物的抗体水平监测。中和试验特异性强，是国际通用的法定方法，可用于日 岸进出口检疫;胶乳凝集试验，简便快速、敏感性高、特异性强，适用于基层现场检测;酶联免疫吸附试验 适用于实验室大批样品检查、产地检疫、流行病学调查和无本病健康猪群的建立。 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D都是标准的附录，附录E是提示的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准由华中农业大学畜牧兽医学院负责起草，农业部动物检疫所参加起草 本标准主要起草人:陈焕春、何启盖、李晓成、吴斌、方六荣、金梅林、邱德新、吴美州。 中华人 民共和 国国家标 准 GB/T 18641--2002 伪 狂 犬 病 诊 断 技 术 DiagnostictechniquesforAujeszksdisease 1 范围 本标准规定了伪狂犬病的诊断方法 本标准适用于猪、羊、犬、猫等及其他易感动物伪狂犬病的诊断。其中病毒分离鉴定、聚合酶链式反 应、家兔接种试验适用于伪狂犬病病毒的检测;中和试验、酶联免疫吸附试验适用于非免疫动物伪狂犬 病抗体的检测以及免疫后抗体水平的监测;胶乳凝集试验适用于实验室和现场对伪狂犬病抗体的早期 检测。 2 病毒分离鉴定 2门 试验材料 改良最低要素营养液((DMEM)培养基配方见附录A(标准的附录)，仓鼠肾细胞(BHK2,)或猪肾细 胞系((PK-15)细胞，新生犊牛血清，青霉素，链霉素，。.22pm微孔滤膜，细胞培养瓶。 2.2 操作步骤 2.2门 病料的采集 对死亡病畜或活体送检并处死的动物，以无菌手术采集大脑、三叉神经节、扁桃体、 肺等组织，冷藏送实验室检测 2.2.2 样品处理:待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DMEM培养 液(见附录A〕制成I，5乳剂，反复冻融三次，经3000r/min离心30min后，取上清液经0.22pm微孔 滤膜过滤，加人青霉素溶液至最终浓度为300lU/m工一、链霉素为100pg/ml，一70℃保存作为接种 材料 2.2.3 病料接种:将病料滤液接种已长成单层的BHK 细胞(或PK-15细胞)，接种量为培养液量的 10Y,37C恒温箱中吸附1h，加人含10%新生犊牛血清(已经过56(’水浴灭活30min，过滤除菌，无支 原体)的DMEM培养液，置37C温箱中培养。 2.2.4 观察结果:接种后364-72h，细胞应出现典型的细胞病变效应((CPE)，表现为细胞变圆，拉网、 脱落。如第一次接种不出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为伪狂犬 病病毒检测阴性 2.2.5 病毒的鉴定:将出现细胞病变的细胞培养物，用聚合酶链反应或家兔接种试验，或作进一步 鉴定。 3 聚合酶链反应 3.1 试验材料 蛋白酶K,f一二烷基硫酸钠(SDS)，苯酚，三氯甲烷，异戊醇(分析纯)，澳化乙锭(EB),TEN缓冲液 见〔附录B(标准的附录)〕。 引物:扩增伪狂犬病毒基因中434-651碱基对((bp)之问217by基因片段，序列为 V-游引物III 中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002-02-19批准 2002-05-01实施