derlin1基因功的初步研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 中国协和医科大学博士学位论文 版权声明 任何收藏和保管本论文各种版本的单位和个人，未经本论文作者及导师授 权，不得将本论文的任何版本转借他人并复制、抄录、影印、扫描、拍照或以 任何方式传播。否则，引起任何有碍作者著作权益之问题，将承担全部法律责 任。  中国协和医科大学博士学位论文 摘 要 Derlin-I是我们实验室于2001年利用消减抑制杂交技术克隆的一个新基 因。近年来的文献报道，该基因定位于内质网膜上，参与错误折叠蛋白从内质 网腔到细胞质的转运。2003年，我们首次发现Derlin．1在人肝海绵血管瘤内皮 细胞中的表达与其它多种血管内皮细胞相比显著下调，同时，我们首次观察到 人肝海绵血管瘤内皮细胞中的内质网异常膨胀。到目前为止，Derlin．1与内质 网结构异常之间的关系未见报道。因此，我们以人肝海绵血管???内皮细胞为模 型，对Derlin-I在内质网上表达的作用及其功能展开了研究。此外，我们通过 生物信息学分析发现，除了内质网以外，Derlin-1也可能定位于质膜上。到目 前为止，Derlin一1在质膜上的定位及功能也未见报道。因此，我们对Derlin-I 新的亚细胞定位及其可能具有的新的功能也展开了研究。 第一部分Derlin·1在内质网上表达的功能及机理研究 采用RT-PCR、Western blot、组织免疫荧光等方法，从体内外水平检测 Derlin-I在多种人血管内皮细胞中的表达，结果显示Derlin-I在人肝海绵血管瘤 内皮细胞中的表达水平显著低于其它血管内皮细胞。采用透射电镜技术，从体 内外水平观察多种人血管内皮细胞中内质网的超微结构，发现Derlin-I表达下 调的人肝海绵血管瘤内皮细胞中内质网异常膨胀，而其它血管内皮细胞中的内 质网结构正常。将含Derlm-I基因的重组质粒转染人肝海绵血管瘤内皮细胞， 发现50个细胞中有26个细胞的内质网恢复正常，而空载体转染的细胞中内质 网仍异常膨胀。根据这些实验结果，我们推断人肝海绵血管瘤内皮细胞内质网 的异常膨胀可能与Dcrlin-I的表达下调有关。 采用RT-PCR、组织免疫荧光等方法，从体内外水平检测未折叠蛋白应急反 应(unfolded protein response,UPR)活化的标记基因Bip或XBPI在多种人血 管内皮细胞中的表达或剪接情况，结果显示，Derlin-1表达下调的人肝海绵血 管瘤内皮细胞中，Bip表达显著上调，XBPI发生了UPR特异的剪接，表明UPR 得到活化。将含Derlin-l基因的重组质粒转染人肝海绵血管瘤内皮细胞，RT-PCR  中国协和医科大学博士学位论文 结果显示，Sip的表达水平下调，XBPI的剪接程度下降，表明UPR的活化程 度降低。根据这些实验结果，我们推断UPR可能是内质网异常膨胀和Derlin-I 表达下调相关的分子机制之一。 第二部分Derlin．1在肿瘤细胞质膜上的表达及其功篚的初步研究 采用RNAi技术敲降Derlin-I在人宫颈癌细胞HeLa中的表达，结果显示， RNAi介导的Derlin-1表达下调对HeLa细胞的增殖、凋亡和细胞周期均无明显 影响，表明Derlin-1对于HeLa细胞的功能并不是必不可少的。 采用多款生物软件预测Dcrlin．1的亚细胞定位，发现内质网驻留蛋白 Derlin-I也可能定位于质膜上。在该部分研究中，活细胞免疫荧光实验结果显 示，Derlin-1表达于多种肿瘤细胞的质膜上，而且呈极性表达，即只表达于细 胞膜的基质面上。竞争抑制实验证明，Derlin-I抗体对肿瘤细胞质膜的染色是 特异的。Derlin-I与CEA的共定位研究进一步证明，Derlin-I表达于肿瘤细胞 质膜上。利用胰酶消化后的肿瘤细胞进行活细胞免疫荧光实验，结果表明质膜 上的Derlin．I蛋白的C端面向胞外。 采用活细胞免疫荧光、冰冻切片免疫荧光等方法，从体内水平检测Dcrlin-I 的亚细胞定位，结果显示，Dcrlin-I表达于活体来源的或切片上的结肠癌细胞 的质膜上．用125I标记的Dcrlin-1抗体进行体内分布及显像研究，结果显示， Dcrlin-I在肿瘤组织特异聚集，表明Derlin-1特异表达于结肠癌细胞的质膜上。 在体外利用Derlin-1抗体封闭结肠癌细胞质膜上的Dcrlin-1，结果显示， Derlin-I抗体对结肠癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期无明显影响，但对结肠癌 细胞与细胞外基质Collagen I之间的粘附有抑制作用，提示Dcrlin-I可能在肿瘤 细胞的粘附中发挥作用。利用Derlin-1抗体进行体内抑瘤实验，结果显示，不 同剂量的Derlin-I抗体均能够显著抑制结肠癌移植瘤的生长，高剂量和低剂量 的抑瘤率分别为54．84％和53．23％