乙酰胆碱酯酶特抑制剂活性研究.pptVIP

——实验设计 乙酰胆碱酯酶抑制剂活性研究 大纲 一、研究背景； 二、研究内容； 三、实验材料及方法； 四、实验数据分析； 四、后续工作展望。 一、研究背景 乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)及其抑制剂 乙酰胆碱酯酶在人体中主要存在于神经肌肉组织的突触后膜上,已知其主要功能是催化乙酰胆碱的分解,在胆碱能神经纤维的信号传导中扮演重要角色。 乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱的分解，直接造成神经信号传递失败,引起老年痴呆症。 AChE抑制剂 AChE抑制剂可竞争性或非竞争性的抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使得乙酰胆碱正常释放，神经冲动正常进行，可起到治疗老年痴呆症的作用。 二、研究内容 1.实验模型： 硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代胆碱,硫代胆碱与显色剂二硫代二硝基苯甲酸（DTNB)迅速作用,生成在412 nm处有光吸收的黄色物质,在酶催化反应的稳态阶段其 OD 值即可代表起始反应速率。 2. AChE抑制剂对AChE IC50值的测定(IC50: 即抑制率为50%时的抑制剂浓度). 3. 样品中AChE抑制剂对AChE的抑制类型研究。 三、实验材料及方法 实验主要仪器、试剂 1.仪器：分光光度计 2.主要试剂：乙酰胆碱酯酶(AChE);50mmol/L、pH8.0的PBS;15 mmol/L二硫二硝基苯甲酸(DTNB)溶液(用50mmol/L,pH8.0PBS配制),15 mmol/ L 硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine,ATch, 用50 mmol/L,pH8.0 PBS配制),4%十二烷基硫酸钠(SDS)等。 三、实验材料及方法 试验方法 三、实验材料及方法 1.样品提纯及处理。 提取样品后，烘干后，用PBS缓冲液定容到终浓度10 mg/L。 2.通过实验选择适当底物浓度范围。 反应体系中的酶量为120 μL 15 mM /3 mL。通过一系列的底物浓度，确定最适浓度范围。 三、实验材料及方法 3. 硫代乙酰胆碱标准曲线的绘制。 分别吸取20，40，60，80，100，120 μL 15 mM 硫代乙酰胆碱标准液，加入等量显色剂二硫二硝基苯甲酸（DTNB)，以PBS缓冲液定量至3 mL测定412 nm处吸光值。横轴为5 mL测试液中硫代乙酰胆碱微摩尔数，纵轴为吸光值，绘制标准曲线。 （用于后面的浓度定量。） 三、实验材料及方法 4. AChE抑制剂对AChE IC50值的测定 2.65 mLPBS(pH 8.0),50μL 乙酰胆碱酯酶(0.85 U/mL) , 100 μL 15 mM DTNB 和样品溶液100μL加入试管，37 ℃预热 2 min，然后加入100 μL15 mM 硫代乙酰胆碱（起始浓度是0.5 mM），在 37 ℃ 保温 20 min 后立即加入1 mL 0.4％SDS 终止反应，将所得溶液立即在412nm下测量吸光值并根据下式计算抑制率： 抑制率(％)=[A对照-(A 样品-A 样品空白)]/A对照×100。 按照公式计算抑制率，以横坐标为酶促反应体系中抑制剂的浓度，纵坐标为抑制率，绘制曲线，计算其抑制率为50%时的抑制剂浓度，即为IC50。 三、实验材料及方法 5. 抑制剂对乙酰胆碱酯酶抑制类型的确定 （1）抑制作用是否可逆 在酶促反应体系中加入不同浓度的酶液，加入一定量抑制剂，以酶浓度为横坐标，以初速度为纵坐标，绘制曲线。根据曲线形态判断抑制作用是否可逆。 （2）抑制动力学常数的测定及类型判定 以不同浓度的硫代乙酰胆碱为底物，加入一定量抑制剂或不加抑制剂，测定反应速度。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Dixon作图法，确定抑制动力学常数并判断抑制类型。 四、实验数据分析 可逆抑制，判断其抑制类型。 竞争性抑制? or非竞争性抑制? or反竞争性抑制? 四、实验数据分析 米氏方程 判断可逆不可逆 四、实验数据分析 四、实验数据分析 四、实验数据分析 四、实验数据分析 二、研究内容 Dixon作图法求Ki 只要以[I]为横坐标，以1/v为纵坐标，采用1个以上的[S]，给出不同[S]时的直线，由这些直线的交点即可求得Ki. 四、实验数据分析 五、后续工作展望 阿尔茨海默病(Alzheimerps disease, AD)又称早老性痴呆(presenil