e-粘蛋白n-糖链的功能及其作用机制的研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docx

Asn．566和Asn一619四个位点的N．糖链去除后，其还有明显的糖链染色，可以初 步说明Asn．634位点上存在糖链。从凝集素ConA的染色结果可以看到Asn-566 和Asn一619 N一糖基化位点突变后，凝集素ConA的染色明显下降而Asn一372和 Asn。554 N．糖基化位点突变后凝集素ConA的染色下降不明显，由此可以推测 Asn一566和Asn-619位点的N．糖链可能是二天线结构。雨仅保留Asn一634位点的 Mu一372／554／566／619突变体也有～定程度的ConA染色，进一步说明Ash．634位 点上有N。糖链存在，且可能也是二天线结构。为了证实Ash一634位点上有N-糖 链且是二天线的结构，我们用Con．A偶联的beads结合Mu-372／5541566／619突 变体细胞株中的E．钙粘蛋白，结果发现，仅剩下Asn-634 N．糖基化位点的E一钙 粘蛋白确实能和CortA．beadS结合，且和野生型转染细胞株的结合量相～致。用 糖苷酶酶切Mu．372／554／566／61 9细胞E．钙粘蛋白的N-糖链，结果发现蛋白条带 位置???有下移，证实了在Asn一634位点上有N．糖链存在。质谱分析的结果也部 分证明了上述糖链的分布情况。 当我们将六个突变体质粒转入MDA．MB．435乳腺癌细胞株后，我们发现 Ash372，Asn554，Asn566，Asn619四个位点的突变体质粒与野生型E．钙粘蛋白一 样均能在蛋白水平表达E．钙粘蛋白，而Asn．634和Ash-all质粒只能在mRNA 水平表达，其蛋白水平的表达相当低，用Western．blot方法几乎检测不到。由此 我们可以推测，Asn一634位点的N．糖链对其蛋白的稳定表达较为重要，为了进一 步证明Asn．634位点的N．糖链对E．钙粘蛋白稳定性的作用，我们还构建了 Mu．372／554／566／619突变体细胞株，即仅保留Ash．634位点的糖链，去除其它四 个位点的糖链，结果发现Mu一372／554／566／619突变体细胞株能稳定表达E．钙粘 蛋白，这就使我们进一步相信Asn一634位点的N．糖链对E．钙粘蛋白的稳定性至 关重要。 为了排除E．钙粘蛋白的不稳定是由于氨基酸的改变所引起，我们用衣霉素 (一种N．糖基化抑制剂)处理Wild．type转染细胞株，结果发现当衣霉素的浓度 大于299／ml时，B钙粘蛋白的表达水平用western．blot方法也几乎检测不到。由 此，我们进一步肯定E．钙粘蛋白的降解是由于Ash-634位的N．糖链的去除所引 起的。 为了阐明E．钙粘蛋白的降解途径，我们分别用溶酶体抑制剂氯喹 (ehloroquine)和蛋自酶体抑制剂ALLN附．acetYl-Leu．Leu-norleueinal)处理 Mu．634细胞株，结果发现溶酶体抑制剂氯喹并不能恢复E．钙粘蛋白的表达，而 蛋白酶体抑制剂ALLN能较明显的恢复Mu．634细胞株E_钙粘蛋白的表达，由此， 我们认为E-钙粘蛋白Ash-634位点的N．糖链去除造成其被降解是通过 proteasome-ubiquintin途径实现的。  此外，我们还发现分别去除Asn372，Asn554，Asn566，Asn619位点N-糖链后， E一钙粘蛋白的分布发生变化。在野生型E．钙粘蛋白转染细胞株中，E．钙粘蛋白较 均匀的分布在细胞表面，而当E．钙粘蛋白的N一糖基化位点发生突变后，E一钙粘 蛋白在细胞中的分布变得不均匀，出现蛋白聚集的现象。为了进一步确定E-钙 粘蛋白的聚集现象是发生在细胞膜还是细胞浆，我们分别收集膜蛋白和浆蛋白进 行Western．blot检测，结果发现E．钙粘蛋白在细胞浆内几乎检测不到，而主要在 细胞膜上表达，说明这种蛋白的聚集现象是发生在细胞膜而不是在细胞浆，同时 这也从另一方面说明，Asn．372，Asn．554，Asn．566和Asn。619 N-糖基化位点突变 后，并不影响细胞对E．钙粘蛋白的运输和投送，即细胞能较正常的将E一钙粘蛋 白运输到细胞膜表面。 为了进一步证明E．钙粘蛋白没有在细胞浆内发生集聚，同时，为了证明E． 钙粘蛋白在细胞膜表面的这种分子间的聚集是否有分子间的二硫键的存在，即 是真正意义上分子间的聚集(aggregation)，还是E一钙粘蛋白分子在细胞膜表面 的成簇(clustering)。我们通过制备两份蛋白样品，其中一份加入13-ME为还原 型样品，另一份不加入13-ME为氧化型样品，分别在沸水中置留5min，比较 westernblot检测结果的差异。若有蛋白质分子间的聚合，将会在氧化型蛋白样 品泳道中看到聚合分子的条带，即在E．钙粘蛋白分子量(120KD)的倍数位置 看到条带。但我们并没有看到在1 20KD的倍数位