ct momp168多表位蛋白疫苗的免疫原性及免疫保护作用分析.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 lII]11 III IIIF F III I II III ＼1 946024 目 中文摘要 1 ● 英文摘要 ．4 l 英文缩写词 ．．8 前 言 9 第一部分 材料与方法 11 结 果 ．16 分析与讨论 ．18 第二部分 材料与方法 20 结 果 24 分析与讨论 27 一 第三部分 ● 0 材料与方法 29 结 果 ．38 分析与讨论 45 第四部分 材料与方法 47 结 果 49 分析与讨论 ．．53 ，J、 结 55 参考文献 ．．56 附 录 ．62 致 谢 ．．63 综述及参考文献 64  温州医学院硕士学位论文 D MOMPl68多表位疫苗的免疫原性及其 免疫保护作用的研究 ‘ 中文摘要 目的： 【1】培养、鉴定和纯化E血清型沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，c0 【2】建立小鼠生殖道E血清cf感染模型 【3】制备沙眼衣原体主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)MOMPl68多表位，研究MOMPl68多表位的免疫原性，包??体液免 疫和细胞免疫； 【4】研究MOMPl68多表位的对小鼠生殖道E血清Cf感染的免疫保护作用。 方法： 【1】将pET32㈣／Ct MOMPl68重组质粒及pET32a(+)转化BL21菌株，通过 IPTG诱导，并经Ni．NTA树脂亲和层析法纯化，制备Ct MOMPl68多表位 和载体蛋t刍(Trx-his)，用于免疫原性和免疫保护作用研究； 【2】采用Hep-2细胞培养E血清型沙眼衣原体(C黟并采用方法PCR，Giemsa、 Lugol，S碘染和间接免疫荧光进行D包涵体的鉴定以及采用反复冻融和超速 办 离心的方法进行。纯化； 3 【3】小鼠生殖道E血清型。感染模型的建立：以106包涵体形成单位(Inclusion forming units，wu)剂量的。原体(Elementary body,EB)感染BALB／c小鼠生殖 道，同时D保存液(SPG)作为阴性对照。小鼠感染。后，通过外生殖道炎症 观察、阴道分泌物Ct PCR鉴定、病理切片等分析小鼠模型是否构建成功； 【4】选择乒8周BALB／e雌性小鼠，每组9只，用MOMPl68多表位重组蛋白免 疫。同时设置PBS、载体蛋白(Trx．his)、灭活沙眼衣原体对照组。采用0、2、 4 W皮下多点注射免疫，共免疫3次；隔周采集阴道分泌液和断尾取血分离 血清，分别进行分泌液IgA和血清培G、IgA、IgM、埯GI、IgG2a、192b、IgG3 的检测，并在末次免疫后取小鼠脾淋巴细胞检测其CTL(Cytotoxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和Elisa检测血清中细胞因子IFN．，t和Ⅱ，4的含 量； 【5】于末次免疫后第2周用106IFU的E血清型Q进行小鼠生殖道感染攻击。 通过下列方法分析其免疫保护作用。1．通过观察小鼠生殖道炎症观察和评分 一●叩；一’ 并观察炎症的持续时间；2．通过ELISA检测小鼠生殖道特异性IgA抗体水平， 及经断尾取血分离血清检测特异性IgG抗体水平；3．Ct攻击前后抗体水平比 较，血清IgG抗体和阴道分泌物IgA；4．隔周采集阴道分泌物进行。分离和  温州医学院硕士学位论文 鉴定、并计数，以分析各组小鼠生殖道cf清除率等；5．Ct攻击后4周，取小 鼠生殖器官进行大体和病理切片观察，以分析cf攻击产生的炎症情况。分析 MOMPl68多表位重组蛋白对小鼠生殖道感染E血清型。攻击的免疫保护作 用。 结果： ^?rj． 【1】通过原核表达系统，分别获得纯化MOMPl68多表位和载体蛋I刍(Trx．his)，蛋 白表达量高达0．9mg／ml、0．6mg／ml。 【2】E血清型Ct经感染Hep-2细胞培养72h,培养细胞经Lugos碘液染色法， Giemsa染色法、间接免疫荧光等方法进行。包涵体鉴定，同时进行PCR检 测。的DNA，结果证实。培养成功。并经反复冻融和超速离心的方法获得 了纯化的E血清型@其删值为lxl08IFU／ml。为建立生殖道感染模型和 检测。奠定了实验基础。 【3】MOMPl68多表位免疫BALB／e小鼠后，采用ELISA方法检测生殖道分泌物 及其血清中特异性抗体水平及其动态变化；采用LDH方法检测CTL的特异 性杀伤及ELISA方法其血清内细胞因子水平。 体液免疫：ELISA结果显示MOMPl68多表位免疫组能刺激机体产生较高 抗灭活C睑菌体的特异性血清IgG和生殖道粘膜Igg抗体水平。随着免疫次数 焉 的增加，抗体水平持续上升；血清抗体的类型以IgGl为主；在末次免疫后检 澳EJlgG抗体水平，MOMPl68多表位组分别与载体组(Trx．his)、