第十八章基因诊断与西基因治疗genediagnosisppt课件.ppt

第十八章 基因诊断与基因治疗 (gene diagnosis and therapy) 本章主要内容 一. 基因诊断概念 利用分子生物学方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断,为治疗提供依据。 二. 基因诊断特点： 针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高 实用性强，诊断范围广 三. 基因诊断常用技术方法 核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 生物芯片 基因测序 hybridization DNA:DNA 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C DNA:RNA 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U RNA:RNA 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C 1.核酸分子杂交的分类 液相杂交 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应； 固相杂交 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－ 2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 3. 常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sandwich hybridization） 原位杂交（ hybridization in situ） （2）Northern 印迹杂交法 （其基本过程类似于上述Southern法） 提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA （3）斑点杂交或狭缝杂交法 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。 用途： 检测样本中存在的微量DNA或RNA （4）菌落杂交 该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。 （5）夹心杂交法 （6）原位杂交 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而 检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。 （二）聚合酶链反应（PCR）技术 （1）DNA模板的热变性 将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。 （2）模板与引物的结合（退火或复性） 将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。 （3）引物延伸 将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按碱基互补原