抗卵清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白 醇溶蛋白elis对a检测方法的建立.docxVIP

抗卵清 抗卵清 独创 独创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含未获得 f注!翅瀣查墓丝霞要挂剔直塑的：奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：豢镶乐签字日期：矽J口年占月／日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊(光盘版)电子杂志社’’用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：寓拳盘 导 签字日期：知l口年；月1日 签字日期：．加／缉乡月夕日 — — 抗卯清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA 抗卯清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA 检测方法的建立 摘 要 过敏性疾病影响着全世界近1／4的人口，其中3‰5％为食物过敏，被世界 卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。2005年7月19日，美国国会 通过一项“食品过敏源标签和消费者保护法(FALCPA)法案，要求食品生产商 清楚地标明该食品是否含有8种最常见的食品过敏原。而在检验检疫系统对进出 口的食品进行常见的8大类过敏原(蛋、奶、大豆、花生、小麦、树果、鱼和贝 类)检测，缺乏相应的标准和方法。本文致力于研究鸡蛋和小麦过敏原的检测方 法，并为制定相应的标准提供理论依据。 卵清蛋白是鸡蛋的主要蛋白质，也是鸡蛋的主要过敏原之一。本文制备了抗 卵清蛋白单克隆抗体，建立了常见过敏原鸡蛋卵清蛋白的ELISA检测方法。以 PBS溶解高纯度卵清蛋白，免疫8周龄的BALB／c小鼠3次，直至效价达到10弓 之后，再加强免疫1次，三天后取小鼠脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞经PEG融合， 经间接ELISA和有限稀释法筛选，获得了6株分泌抗卵清蛋白单克隆抗体的杂交 瘤细胞株，分别是OVA．1C6、OVA．2F9、OVA．2D8、OVA．2D2、OVA．3H6、 OVA．3G9，培养上清效价分别为1：30000、1：30000、1：10000、1：10000、1：5000、 1：50000，细胞冻存复苏后效价不变；OVA一1C6的亚型是IgG2b，OVA．2D8和 OVA．2D2是IgG2a，OVA．2F9、OVA．3H6和OVA．3G9的亚型是IgGl；与BSA、 猪血清、兔血清均没有交叉反应。选取其中抗体效价最高的两株杂交瘤细胞 OVA-2F9和OVA-3G9，制备腹水以及纯化，纯化后的抗体分别与HRP偶联。将偶 联成功的HRP-2F9抗体作为酶标抗体，ovA一3G9作为包被抗体，经方阵滴定法确 定最适的包被抗体浓度是1：200和酶标抗体工作浓度是1：1000，在最适浓度下 优化双抗体夹心ELISA测卵清蛋白的条件。利用优化后的试验条件进行ELISA 双抗体夹心法检测，建立卵清蛋白的标准曲线。检测的最佳线性范围是 97．66ng／ml,-,6250ng／rnl，r0．995，最低检测限度为97．66ng／ml，大约O．1ppm。在 同一次实验内，样品的回收率在91．92％--100．34％之间，精密度CV为 1．22％0-5．14％，3次试验间精密度CV为3．17％-6．83％。可在4。C放置一个月。与 1．22％0-5．14％，3次试验间精密度CV为3．17％-6．83％。可在4。C放置一个月。与 鸡肉、猪肉、牛肉无交叉反应，对鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋中的卵清蛋白具有特异性。 自制的ELISA试剂盒与RIDASCREEN成品试剂盒检测实际样品进行比较结果基 本相符，并且检出灵敏度为成品试剂盒(1ppm)的10倍。 醇溶蛋白是小麦等谷物类的主要过敏原，约占小麦种子贮藏蛋白总量的 40％，因此可以作为小麦的检测指标，本文建立常见过敏原小麦醇溶蛋白的ELISA 检测方法。以65％乙醇溶解sigma公司的小麦醇溶蛋白免疫BALB／c小鼠，免疫 血清作为阳性对照。以鼠抗醇溶蛋白单抗为包被抗体，HRP标记兔抗醇溶蛋白多 抗为酶标抗体，以方阵滴定法确定包被抗体的包被浓度是2l-tg／ml和酶标抗体的 最适工作浓度是1：8000，在最适浓度下选择合适的封闭液，即含10％胎牛血清的 PBST