抗瘦素纳米抗体的筛选及对制备论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 大连理工大学专业学位硕士学位论文摘 大连理工大学专业学位硕士学位论文 摘 要 瘦素是一种与能量代谢、免疫、生殖等相关的多功能细胞因子，其在血液中的含量 异常会导致肥胖、营养不良、心血管疾病、肿瘤、肝病等多种疾病，特别是终末期肾衰 患者广泛存在瘦素水平过高的问题，由此导致肾衰症患者营养不良、高血压、胰岛素抵 抗等并发症，这些并发症严重影响了患者的生活质量，因此开发特异性抗体实现瘦素水 平的检测与去除将具有非常重要的临床意义。纳米抗体由于其诸多优良特点，成为该方 面研究的最佳选择。获得足够量的抗原是进行抗体筛选的前提，由于血液中瘦素含量较 低，本论文首先进行了瘦素的制各，然后进行抗体的筛选。论文研究内容如下： (1)瘦素制备。根据人瘦素氨基酸序列，构建了原核表达载体pET23a．1eptin，优 化后的表达条件：活化的菌体以1％转接到新鲜培养基后，恒温摇床37℃连续培养8h， 期间不加入IPTG。瘦素以包涵体形式存在于大肠杆菌中，通过包涵体的洗涤、溶解、 复性、强阴离子交换色谱，最终获得纯度95％的重组人瘦素蛋白。 (2)纳米抗体筛选。通过五轮筛选，从瘦素免疫噬菌体库和非免疫库中分别得到 18种和5种特异性纳米抗体序列，因有一序列重复，最终得到22种。经Elisa方法检测， 选取其中结合活性较高的6种进行后续表达纯化。 (3)纳米抗体表达。利用PCR、双酶切等手段构建6种纳米抗体的表达载体，转 入宿主菌Ecoli Shuffle T7进行表达。除纳米抗体A11表达量较低外，纳米抗体A5、 A12、A23、A33和B1表达量均可占总蛋白30％，且有可溶性表达。选择A5、A33进 行表达纯化，得到纯度达90％的纳米抗体。经Elisa检测对瘦素有结合活性。 关键词：瘦素；噬菌体筛选；蛋白纯化；纳米抗体 万方数据 抗瘦素纳米抗体的筛选及制备The 抗瘦素纳米抗体的筛选及制备 The Biopanning and Preparation ofNanobodies anti—Leptin Abstract Leptin is a kind of multi—target organ versatile protein hormones．It is involved in energy metabolism，the immune，reproductive and other physiological activities in human body．The abnormalities of leptin level in the blood can lead to obesity or malnutrition，cardiovascular disease，cancer，liver disease and other diseases．Patients with end—stage renal failure are in lower glomerular filtration rate，and the removal of leptin in the body relies mainly on renal metabolism，SO most patients with high leptin levels in the blood will have complications of malnutrition，high blood pressure，insulin resistance．Therefore，the development of specific antibodies to achieve leptin detective and removal will have very important clinical significance．Because leptin concentation in the blood is low，we got leptin by prokaryotic expression first，followed by biopanning of phages．The research contains what listed below： (1)The preparation of leptin．Structure recombinant plasmid pET23a—leptin．Then getting the expression conditions of recombinant human leptin protein in E coli BL2 1 fDE3)：1％of activated cells are transferred to flesh