抗il-13全人源单链时抗体的筛选 可溶性表达及鉴定.docxVIP

达：以生物素化lL一13蛋白为抗原，对前期构建的天然抗体文库利用噬菌体 达：以生物素化lL一13蛋白为抗原，对前期构建的天然抗体文库利用噬菌体 展示技术进行3轮富集，通过ELISA检测有30％的scFv与IL-13有结合性；将得 到的阳性克隆子与IL．4，TSLP通过ELISA检测特异性，结果显示有一些单克隆 子与lL．4，TSLP不结合，即不显色，说明此单克隆子有较好的特异性，与其 他细胞因子交叉反应较低。挑选14个OD值较高的抗|L-13．scFv阳性克隆子进 行PCR扩增，用BstNI酶切方法对其进行指纹图分析，将指纹图谱不同的克 隆子送去测序。结果显示在单链抗体氨基酸序列中出现了琥珀终止密码子， 位于第32位氨基酸处。对琥珀密码子进行校正，利用单点突变的方法突变 终止密码子中的一对碱基后变为氨基酸TrP(w)。将校正后的基因双酶切后 与原核分泌性表达载体LZl6连接，构建重组表达载体IL-13．scFv／Lzl6，并转 入大肠杆菌DH5aF’进行测序，测序正确后进行蛋白表达和纯化。对单链抗 体进行表达及纯化，结果显示scFv在大肠杆菌DH5aF’中主要集中分泌在细 胞周质间可溶性表达，抗体具备生物学活性，SDS．PAGE电泳显示纯化后的 抗IL-13一scFv蛋白分子量大小为26KDa左右。(3)抗lL．13全人源单链抗体特 性分析：Western Blot结果表明有显色，且条带唯一，即纯化得到的蛋白为 抗IL-13一scFv。竞争ELISA结果显示：IL．13Ral和筛选的单链抗体可竞争性的 与IL-13结合，说明IL．13Ral与单链抗体作用于IL-13的相同抗原表位，可有 效的封阻IL一13／IL-13Ral的信号通路具有生物学功能。大分子相互作用实验 (Blitz)结果显示抗IL．13全人源单链抗体与相应抗原IL一13反应较好且得到 亲和力KD值为10～，可见筛选得到抗lL-13全人源单链抗体有较好亲和力； 结论：成功筛选到具有体外中和活性、亲和力相对较高、特异性较好 的抗IL-13单链抗体。 关键词：IL．13；全人源单链抗体；噬菌体展示 万方数据 Selection，soluble Selection，soluble expression and identification of full human scFvs against IL一13 Abstract：bjective：Since the 1 980s，with mature of the recombinant DNA technology，we widely use its in molecular biology and transform genetic structure of antibodys，technology of antibody preparation developed from a polyclonal antibody,a monoclonal antibody to genetically engineered antibody· With the continuous development of preparation for various antibody technology in recent years，，genetically engineered antibody has experienced Fab fragment，scFv antibodies，fully human antibodies，which has a small molecular weight，penetrming strong，it does not bind to Fc receptors，easy characteristics of operation，become genetically engineered antibody research focus．Bronchial asthma is a complex disease caused by a combination of multiple genetic and environmental factors．there has been no successful attempt to target any specific genetic factors to treat bronchial asthma· According to the pathogenesis of asthma from a newly discovered in molecular basis of immunology，molecular pathophysi