lncRNA参与幽门螺杆菌感染相关胃癌的功能及机制研究-生物化学与分子生学专业毕业论文.docxVIP

北京协和医学院硕士研究生论文TBST 北京协和医学院硕士研究生论文 TBST Tris．bu行旨ed saline with Tween 20 TE Tris．EDTAbuffer TEMED N，N．N’，N-tetramethyl ethylene diamine TNF-旺 tumor necrosis factor-a U Unit Amp Ampieillin HP Helicobacter Pylori Cfu colony-forming units Bp base pair Min minute rpm rotation per minute 3 万方数据 北京协和医学院硕士研究生论文中文摘要 北京协和医学院硕士研究生论文 中文摘要 胃癌(gastric carcinoma，GC)是最常见的恶性肿瘤之～，是我国高发肿瘤， 胃癌死亡率目前排在肺癌和肝癌之后，位居第三位，五年生存率仅有20％左右，严 重威胁着人类的生存和健康。近年来研究发现，长链非编码RNA(10ng non—coding RNA，IncRNA)在多个层面参与细胞分化、个体发育等多种生物学行为。然而，对 于大部分的非编码RNA的功能我们仍知之甚少。本研究旨在寻找在幽门螺杆菌 (Helicobacter Pylori，HP)感染相关胃癌中发挥重要功能的lncRNAs，并研究其功 能和机制，为胃癌的诊断和治疗提供分子生物学基础。 我们在前期研究中基于HP国际标准株NCTCll637体外感染的人胃黏膜正常 上皮GES一1细胞、人正常胃黏膜组织(HP阴性)、慢性萎缩性胃炎组织(HP阳性) 和胃癌组织(HP阳性)临床样本，利用高通量的检测方法，研究HP阳性的相关胃 癌中lncRNA的动态表达变化规律，寻找正常组、慢性炎症组、癌症组中的差异 IncRNA，并与HP感染的GES．1细胞的lncRNA差异表达谱比对，利用生物信息学 方法对lncRNA表达谱进行了初步筛选。在HP感染的人胃黏膜正常上皮细胞 (GES．1)芯片中发现124个上调倍数大于10倍的lncRNAs及81个下调倍数大于 10倍的lncRNAs。在胃癌组织芯片中，发现在胃癌及胃炎组织中均上调的lncRNA 259个，均下调的IncRNA 221个。将GES—l细胞中差异表达的lncRNAs与组织样 本中差异表达的lncRNAs进行比对筛选，共发现18个在两个芯片检测中均有差异 表达的lncRNAs。在炎症细胞模型(HP感染的GES一1细胞)中进行Real—time PCR 进行验证，发现其中NR 038975、NR 003605、LncHP、PVTl在感染后GES一1细 胞中呈现明显上调，且表达丰度较高，而LINC00260表达呈显著下调，结果与芯片 趋势相符。进一步通过Real—time PCR对上述lncRNAs在胃癌组织及癌旁表达量进 行检测，结果显示NR 038975、LncHP在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差 异显著，与组织芯片趋势相符，而LINC00260在已有胃癌组织及癌旁组织验证过程 中发现其表达也出现了一定的上调，但结果无统计学意义。PVTI已有文章验证过 在胃癌组织中的表达，遂本研究未对其再进行组织验证。 综合上述验证结果及表达差异、表达丰度、生物信息学分析等因素，进一步选 取2个上调基因LncHP和PⅥl，1个下调基因LINC00260进行深入的功能研究。 分别敲低目的基因后，通过细胞增殖检测实验(MTS)及划痕愈合实验检测该基因 对细胞增殖及迁移能力的影响，发现敲低LncHP、PvTl及LINC00260后对细胞的 增殖能力无显著影响，但是会不同程度的抑制细胞迁移。为了探究以上目的基因在 HP感染引起的炎症反应中可能发挥的功能，在胃癌细胞中分别敲低以上基因后， 再用HP感染细胞。发现在分别敲低LncHP、PVTI及L1NC00260后，在HP感染 万方数据 北京协和医学院硕士研究生论文的胃癌细胞中，炎症细胞因子TNFll、IL一1B、IL．8的表达受到明显的抑制。 北京协和医学院硕士研究生论文 的胃癌细胞中，炎症细胞因子TNFll、IL一1B、IL．8的表达受到明显的抑制。 为了更进一步研究目的基因序列的功能，通过生物信息学分析及polyA尾鉴定 实验对LncHP及LINC00260的序列特征进行了分析。结果显示，LncHP和 LINC00260的序列均具有polyA尾结构。LncHP及LINC00260均具有复杂的二级 结构，均不具有完整的开放阅读框(open read frame，ORF)，不能编码蛋白。由 于LncHP在炎症细胞模型和组织中的表达差异最显著，所以最终选择LncHP进行 深入研究。 通过FISH实验和胞浆胞核分离实验结果显示，LncHP主要定