利用体内转录系统对o型fmd洗v china99s株的拯救.docxVIP

甘肃农业大学2008届硕士学位论文利用体内转录系统对0型FMDV 甘肃农业大学2008届硕士学位论文 利用体内转录系统对0型FMDV China99／S 株的拯救 摘 要 提取FMDV China99／S株组织样品总RNA，利用设计的引物，分4段进行扩 增，获得了覆盖全基因组的重叠片段(A、B、C和E)，然后利用限制性内切酶分 别酶切含有鼠源聚合酶I的pPIeDNA3．1(+)载体和A、B、C和E，依次定向克 隆到已经构建的pPIcDNA3．1(+)载体内，得到FMDV China99／S株全长eDNA 重组质粒。对该质粒进行核苷酸序列测定，结果表明，China99／S株基因组全基 因组序列长8116nts，其中5HqCR长1064 nts，含有由引物引入的41个C的poly (C)片段；蛋白编码区的核苷酸序列为6318nts，编码一个长2106个氨基酸的 聚合蛋白；3，NCR长93nts，其后是至少含有38个A的poly(A)尾巴。经全 序列分析表明，该基因组没有终止性突变，开放阅读框能够被正确编码，符合深入 做下游工作的要求。将获得的FMDV China99／S株全长eDNA重组质粒用脂质体 转染法导入BHK-21细胞，传代培养，可以观察到典型的FMDV致细胞病变效 应。使用电镜、反向间接血凝鉴定试验、间接免疫荧光试验、ImPCR和序列测 定进行检测，结果表明，从该系统中拯救出了具有感染性的FMDV China99／S株 重组病毒。利用蚀斑、TCID50、LD50及病毒生长曲线的测定对拯救出的FMDV China99／S进行了病毒生物学特性测定。 本实验是采取聚合酶I转录系统进行病毒体内拯救。首次证明了聚合酶I有 转录8．2 kb基因(内含41个C碱基的poly(C)片段)的能力。有助于研究RNA病毒介 导的复杂感染过程，为病毒分子生物学及应用研究提供了较为有价值的工具。为 研究FMDV功能基因组学、致病和变异的分子机制提供一个技术平台，为研制嵌合 病毒、基因缺失疫苗和标记疫苗等奠定了基础。 关键词：FMDV；全长cDNA克隆：体内转录；病毒拯救 甘肃农业大学2008届硕士学位论文Recovering 甘肃农业大学2008届硕士学位论文 Recovering of O type FMDV China99／S strain in vlvo tranSCrlDtlVe system ABSTRACT The total RNA was extracted from the tissue samples of FMDV China99／S strain and four overlapping fragments(A，B，C and E)were amplified using RT-PCR．The pP eDNA3．1(+)vector with RNA polymerase I and A，B，C，E fragements were digested respectively by restriction endonucleases，and subsequently ligated to constructed transcription pP eDNA3．1(+)vector to produce recombinant plasmid of FMDV China99／S full—length eDNA．The analyses of nucleotide sequences shows that the genome of FMDV China99／S strain is 8 1 1 6 nucleotides in length，and the open reading frame(ORF,63 1 8 nucleotides which encoding 2 1 06 amino acids)is flanked by a 5non-coding region(5’-NCR)of 1 064 nucleotides(including 41 C residues poly(C)tract)and a Y-NCR of 93 nucleotides，the poly(A)tail at least 3 8 A residues．Recombinant plamid of FMDV China99／S full-length eDNA Was transfered into BHK-2 1 cells、析th liposome and subcultured to be observed typical FMDV pathologyical changes．The electron microscope、indir