酒精对胎鼠脑新皮质神经干细胞四自我更新和分化的影响分析.docx

复旦大学博士学位论文 复旦大学博士学位论文 中文摘要 酒精对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新 和分化的影响研究 中文摘要 孕期饮酒可导致多器官系统生长发育异常和生长发育迟缓以及功能障碍，其 中脑是酒精作用的最主要靶器官之一。以往临床病例显示孕期饮酒所导致的脑结 构和功能发育异常主要表现为神经元的形态和功能发育异常，而神经胶质细胞对 神经元具有营养和支持作用，故研究多侧重于酒精对神经元和神经胶质细胞的影 响。 神经干细胞的发现和分离培养为毒理学研究提供了有利工具。神经干细胞具 有自我更新和多向分化能力，通过自我更新补充干细胞库，通过多向分化能力产 生神经元和神经胶质细胞。外源性化学物干扰神经干细胞自我更新和分化将影响 神经系统的正常发育和功能。本课题从胎鼠脑皮质分离纯化神经干细胞，研究酒 精对神经干细胞自我更新和分化的影响和可能机制，以期为探讨其作用机制提供 科学依据。 1大鼠胚胎脑新皮质神经干细胞的体外分离培养方法研究 本研究从孕14天SD大鼠胚胎脑分离新皮质，通过机械吹打改善细胞分散 状态、优化无血清培养基条件，从而改进神经干细胞的培养方法。利用神经干细 胞标志蛋白(nestin和SOX2)、增殖和克隆成球能力以及多向分化能力测试三方 面对神经干细胞鉴定。以该法培养的神经干细胞nestin蛋白呈强阳性表达，SOX2 阳性表达率达99％以上，BrdU掺入阳性，培养3天后细胞量为接种量的lo．55 倍，6日克隆成球率为(33．00+4．40)％。经相应特异性标志蛋白检测证实神经干细 胞经诱导分化后可形成神经元(MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细 胞(04)。本法获得的神经干细胞纯度和细胞产出率高，具有强自我更新和多向 分化能力，可为毒理学研究提供良好的模型。 2酒精对胎鼠脑新皮质神经干细胞超微结构的影响 利用透射电镜和扫描电镜技术观察神经干细胞的超微结构。神经球结构较松 散，细胞主要为核质比大的原始细胞。神经球呈现异质性，由电子密度高的暗细 胞和电子密度低的明细胞组成。可观察到不同分裂时相的细胞。存在细胞凋亡， 一些细胞吞噬功能旺盛。细胞表面有很多突起和微绒毛，可能是神经球细胞维持 球体、物质和信息交换的重要结构基础。 复旦大学博士学位论文 复旦大学博士学位论文 中文摘要 酒精造成神经干细胞线粒体损伤，损伤程度呈剂量效应关系。25mM酒精引 起线粒体轻度肿胀，50mM酒精引起细胞线粒体中度肿胀，嵴断裂缺失。100mM 剂量组可见细胞线粒体损伤程度进一步加剧。扫描电镜下酒精使神经球结构更为 松散。酒精导致的线粒体损伤可能引起细胞凋亡。 3酒精对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新的影响及作用机制研究 3．1酒精对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新的影响 利用台盼蓝染色计数存活细胞、神经干细胞成球率实验(成球个数和球径)、 BrdU掺入率检测神经干细胞的自我更新能力。结果表明，随酒精剂量增加活细 胞数下降，100mM酒精组活细胞数是对照组的78％。神经干细胞成球率随酒精 剂量增加而下降，神经球直径也随酒精剂量增加而降低，呈剂量依赖关系。BrdU 掺入率反映DNA合成状况，随酒精剂量增加而下降，呈剂量效应关系。该结果 表明酒精能够抑制神经干细胞的自我更新。 3．2酒精对胎鼠脑新皮质神经干细胞细胞周期和相关调控基因的影响 采用流式细胞术分析了神经干细胞的细胞周期。酒精使S期和G2／M期细胞 数下降，G0／G1期细胞数增加。未观察到凋亡峰。上述结果表明酒精能够引起神 经干细胞G0／G1期阻滞，延缓细胞周期进程。 利用荧光定量PCR技术检测细胞周期抑制基因p53、p16、p21和p27 mRNA 的表达。酒精能够诱导神经干细胞p16和p21mRNA表达的增加，p53和p27mRNA 表达未发生显著性改变(P0．05)。表明酒精可通过细胞周期抑制基因p16和p21 抑制GI／S细胞周期检验点的转换。细胞周期阻滞可能预示着神经干细胞命运的 转变，向更为成熟的前体细胞分化的启动。 3．3酒精对胎鼠脑新皮质神经干细胞标志物的影响 利用荧光定量PCR技术检测神经干细胞标志物Nestin、Sox2和CDl33 mRNA的表达，利用流式细胞术检测SOX2蛋白的表达。神经干细胞Nestin mRNA表达随酒精剂量增加而下降，Sox2和CDl 33mRNA表达未受影响，SOX2 阳性细胞数未受影响，但丰度增加。酒精抑制Nestin和促进SOX2表达可能与分 化的启动有关。 3．4酒精对胎鼠脑新皮质神经干细胞Egfr和Fgfrl mRNA表达的影响