连续化酶膜耦合法制备高行活性ace抑制玉米肽分析.docxVIP

连续化酶膜耦合法制各高ACE抑制活性玉米肽研究 摘 要 为了利用植物蛋白资源，提高大宗农产品的副产品——玉米黄粉的附加值，本 文以玉米黄粉为原料，采用酶解和膜分离耦合技术对连续制备高活性血管紧张素转 化酶(ACE)抑制肽的制备工艺进行了优化，采用纳滤技术进行脱盐；建立了碱性 蛋白酶Alcalase连续酶解玉米蛋白动力学模型；考察了玉米ACE抑制肽的活性稳定 性；用自发性高血压大鼠(SHR)模型研究了玉米肽(CP)体内降血压效果并对其 作用机理进行了初步研究；并采用HPLC／MS／MS法对部分玉米肽的一级结构进行了 鉴定。主要结果如下： 1．酶膜反应器法动态制备ACE抑制玉米肽工艺优化 Alcalasc连续酶解玉米蛋白的最佳工艺为：温度45℃，循环速度5L／min，酶底 比1．5％，料液比3％，在此操作条件下制得玉米肽的ACE抑制率为：89．82％，蛋白 质回收率为73．48％，平均膜通量为83．52％；产品的ACE抑制率较???歇式水解工艺 提高了20％以上。 2．玉米活性肽的超滤分级及纳滤脱盐 超滤处理得到的三个玉米肽级份(Mml kDa、Mm3 kDa、Mm5 kDa)中， 以Mm3kDa的玉米肽级份的ACE抑制活性最高，其半抑制浓度最低(ICso=0．29)， 相对于仅经过一次超滤处理的Mm5 kDa级分来说，IC50值降低了四倍。最佳纳滤 脱盐操作条件为：在pH值为9，压力为8 bar，循环次数4的操作条件下，对玉米 肽进行脱盐，处理后料液的ACE抑制率为86．77％，脱盐率为89．72％，纳滤处理前 后玉米肽ACE抑制活性基本保持稳定。 3．连续酶解动力学模型 拟合得到了水解度与底物浓度及水解时间的关系式为： 。H=写笔詈蔓器。参照此方程，可预测其它底物浓度下的水解度随时 间的变化趋势；并进一步建立了Alcalase连续水解玉米蛋白过程动力学模型： 面0．507c=面XCso+轰，得到米氏常数Kn=22．34 gL～，V眦_o．507 gL．1min．1。  华中农业大学2011届硕士研究生学位论文 4．玉米肽的稳定性及其体内降血压活性 ①本实验中得到的三种级分Mm1 kDa、Mm3 kDa和Mm5 kDa对温度均 具有良好的稳定性，能耐受100。C以内的热处理；各级份在pH=8左右稳定性良好。 体外模拟消化试验结果显示，玉米肽具有一定的抵抗胃肠道消化酶消化的能力，其 中MATI3kDa级份玉米肽在模拟消化前后，其活性均高于其它两个级分，经过胃肠 消化酶消化后，仍能保持90％以上的ACE抑制活性。 ②在短期给药试验中，对SHR灌胃玉米肽及阳性对照卡托普利(Captopril) 1h后，与模型对照组相比，玉米肽高低剂量组(100 mg／kg·bw)、中低剂量组 (50mg／kg·bw)和低剂量组(25 mg／kg·bw)血压值均极显著降低(P0．01)，最大 收缩压降幅分别为26．57 mmHg，19．57 mmHg和17．91 mmHg，高剂量组(100 mg／kg·bw)降血压效果虽不及Captopril，但其降血压持续时间比Captopril长，从4h 开始，高剂量组玉米肽组的降压效果略高于Captopril组，CP各剂量组可维持降血 压效果5h左右。 ③在长期给药试验中，对SHR灌胃不同剂量玉米肽及阳性对照卡托普利 (Captopril)30 d后，CP各剂量组和阳性对照组(2 mg／kg·bw Captopril)SHR的 血压值，均随着连续给药时间的延长，血压降幅不断增加。连续灌胃30 d后，阳性 对照组及CP高低剂量组(100 mg／kg·bw)、中低剂量组(50 mg／kg·bw)、低剂量 组(25 mg／kg·bw)SHR其收缩压最大降幅分别下降39．39 mmHg、34．45 mmHg、30．95 mmHg和27．49 mmHg；而对血压正常的Wistar．I(yoto大鼠，长期灌胃高剂量(100 mg／kg·bw)玉米肽后血压值无显著变化。 ④Captopril和CP主要通过抑制肺脏和睾丸组织中ACE酶活，起到降血压作用， 肺和睾丸是CP和Captopril作用的主要靶器官，且CP高剂量组(100 mg／kg·bw)的 抑制效果略高于Captopril(2 mg／kg·bw)。 5．玉米ACE抑制肽的结构初探 经HPLC．MS／MS在线分离，结合蛋白质数据库信息比对，新鉴定了三种源于 Mm3 kDa级分的玉米肽，其氨基酸序列分别为QQLLPF、QQFLPF和QLLPF，这 三种小肽均富含疏水性氨基酸，氮端和碳端的前三个氨基酸均相同，用现有的构效 关系理论分析，均为ACE抑制肽。 关键词：玉米肽、超滤、纳滤、原发性高血大鼠(SHRs)、动力学模型、一级结构 Ⅱ  连续化酶膜耦合法制备高