CMTM5对人肾癌细胞ACHN的生学行为影响的初步研究-泌尿外科专业毕业论文.docx

博士学位论文的细胞内化，导致EGF．EGFR复合物的减少，进而抑制EGFR下游信号通路 博士学位论文 的细胞内化，导致EGF．EGFR复合物的减少，进而抑制EGFR下游信号通路 的激活，促进抑癌基因Bad的磷酸化，抑制细胞生长；还会可以通过c—MET信 号传导通路，减低癌细胞的侵袭性。同时CMTM8还可使癌细胞对化疗药增加 敏感，和化疗药物起到互相协同抗癌作用。 目前的研究表明在前列腺肿瘤，胰腺肿瘤，宫颈癌，胃癌等多种肿瘤组织 中，CMTM5表达远远低于相对应的正常组织。而通过技术手段在肿瘤细胞中 恢复CMTM5表达后，肿瘤的生长可以受到抑制，说明其可能是一个抑癌基因。 也有更深入的研究表明CMTM5可能是通过抑制PDK／AKT信号通路来减慢癌 细胞生长速度，而且CMTM5可以增强肿瘤坏死因子的抗肿瘤细胞生长作用。 P13K／AKT信号传导通路是生物体内最主要的信号传导通路之一。在‘肾细 胞癌中，目前已经证实癌细胞可以通过自分泌VEGF，VEGF与受体VEGFR结 合，激活上述信号通路抑制细胞凋亡，促进细胞生长。如何抑制上述通路的在 肿瘤中的激活故而成为了目前生物学研究的一大热点。我们推测CMTM5是否 在肾癌中也可以通过上述通路抑制肿瘤生长。 本研究的目的是研究CMTM5在肾癌组织和正常肾组织中的表达差异，并 在肾肿瘤细胞系中进一步进行结果验证，探索其与临床病理学的关系。恢复 CMTM5在肾癌细胞中表达，并通过荧光定量PCR分析和蛋白质印迹分析的手 段进行验证，观察分析其对肾肿瘤细胞ACHN的增殖、细胞周期、凋亡以及细 胞迁移侵袭等生物学行为的影响，并初步探索探讨CMTM5在这一过程中的作 用机制。 实验：方法 1．利用组织芯片和免疫组化技术检测75例肾透明细胞癌患者肿瘤组织以及相 匹配的正常组织病理切片中CMTM5的蛋白表达情况，分析其表达水平及与肿 瘤恶性度之间的关系。另外选取肾癌细胞系ACHN、CAKll和OS．CA．2细胞， 以HK2细胞作为对照，对各细胞株的CMTM5基因表达进行定量PCR检测。 2．将含CMTM5基因慢病毒载体，通过慢病毒转染入肾肿瘤ACHN细胞株， III 万方数据 中文摘要使ACHN细胞表达CMTM5，通过荧光定量PCR以及蛋白质印迹法分析转染 中文摘要 使ACHN细胞表达CMTM5，通过荧光定量PCR以及蛋白质印迹法分析转染 CMTM5慢病毒载体的实验组、转染慢病毒空载体的阴性对照组及未转染的空 白对照组等3组中CMTM5的表达情况。 3．设立转染CMTM5载体的实验组、转染空载体的阴性对照组及空白对照组 三组，以Cell Counting Kit．8方法测定肿瘤细胞生长增殖能力、以流式细胞技术 对肾肿瘤细胞周期和凋亡进行检测及以Transweli技术对实验对象的细胞迁移、 侵袭能力检测，明确CMTM5对肾肿瘤细胞ACHN的各种生物学特征的影响。 4．通过上述的检测结果结合文献推测CMTM5作用的可能信号通路P13K／AKT 进行蛋白免疫印迹检测。检测CMTM5过表达后ACHN细胞P13K／AKT通路以 及下游中增殖相关的P21、cyclinD、cyclinE，凋亡相关的Bcl2、Bax、Bad、cleaved caspase3以及侵袭相关的MMP家族蛋白的表达变化。 5．统计学处理 采用SPSS20．0软件包进行数据的统计分析处理，所有计量资料以均数±标 准差(Mean+SD)表示。昔方检验方法分析免疫组化CMTM5表达与临床因素之 间的关系。细胞系实验结果多组数据之间均数的比较采用单因素方差分析 (One．Way ANOVA)，如方差分析具有显著性差异，则进一步最小显著差数法 (LSD法)比较两两之问的差异，若组间方差不齐，可采用Dunnett T3法分析两 两之间的差异；指标间相关性以Pearson相关系数来表示，P0．05表示差异有 统计学意义。 实验结果 1．通过组织芯片技术以75个肾细胞癌组织作为实验组，以每个癌组织配对的癌 旁正常肾组织作为对照组。SP两步法进行免疫组化检测得出CMTM5主要表达位 置在细胞膜，且在正常组中(73／75，97％)的表达明显高于肿瘤组(27／75，36％)， 差异具有统计学意义(氏0．001)。但临床病理学分析显示CMTM5的表达程度与 。肾癌患者年龄，性别，肿瘤的分期以及分级等因素的关系不具有统计学意义(均 P0．05)。荧光定量PCR检测同样证实了在ACHN，CAKll以及OS．CA．2等肾肿瘤 IV 万方数据 博士学位论文细胞系中，CMTM5 博士学位论文 细胞系中，CMTM5 mRNA表达也均要显著低于作为对照的HK2细胞(均P 0．001)。 2．成功建立表达CMTM5基因的ACHN细胞株，经荧光定量PCR检测和细胞蛋白 质印迹检测检测，