凝胶层析法分离纯化二蛋白质.pptVIP

凝胶层析法分离纯化蛋白质 【目的】 掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。 总结： 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 【实验器材】 层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿 【实验试剂】 待分离样品 葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液 【操作方法】 一、凝胶的处理 　　　Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充分溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。 二、装柱 关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，将浓浆状的凝胶缓慢