实验四小麦萌发前后淀粉酶洗活力的比较1.pptVIP

小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 实验目的 1 熟悉分光光度计的原理和使用方法； 2 学习测定淀粉酶活力的方法； 3 了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 实验原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n+nH2O——nC12H12O11 麦芽糖有还原性，能使3，5－二硝基水杨酸还原成棕色的3－氨基5－硝基水杨酸，后者可用分光光度法测定。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540 nm 波长下测定吸光值，便可求出样品中还原糖的量 休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。 本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。 实验材料 1 器材：移液管 乳钵 离心机 水浴锅 分光光度计 2 试剂和材料： 小麦种子， 标准麦芽糖溶液， pH6.9磷酸缓冲液，淀粉溶液 3 ，5-二硝基水杨酸， 氯化钠 操作步骤 1.种子发芽 小麦种子浸泡2.5小时后，放入25 ℃恒温箱内或在室温下发芽。（一般在光照培养箱内，2-3天后开始萌发） 2.酶液提取 取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加1% 氯化钠溶液10 mL, 用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后将提取液离心6～7分钟（1500 r/min）。将上清夜倒入量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将酶提取液稀释10倍（ 1 mL 酶提取液+9 mL缓冲液）。 取干燥种子或浸泡2.5小时后的种子15粒作为对照（提取步骤同上） 。 思考题 1 提纯酶的过程需要注意什么问题？ 2 为什么测定酶活力时要保温3分钟？反应后又放入到沸水浴？ 3 研磨时加加1% 氯化钠溶液的作用（离子强度和渗透压）。 College of Life Sciences Central Laboratory of Biology 萌发和出苗 germination vs. emergency 3.酶活力测定 （1）取25 mL刻度试管4支，编号。 按下表要求加入各试剂（各试剂须在25℃预热10分钟） 。 0.5 - - - 水（mL） 1 1 1 1 1%淀粉溶液（mL） - 0.5 - - 标准麦芽糖溶液（mL） - - 0.5 0.5 酶液（mL） 空白管 标准管 发芽3或4天幼苗的酶提取液 干燥种子（或浸泡2.5小时后）的酶提取液 4 3 2 1 试管号 试剂 将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3分钟后，立即向各管中加入1% 3，5－二硝基水杨酸溶液2 mL 。 （2）取出各试管，放入沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25 mL。将各管充分混匀。 （3）用空白管作对照：在A540 nm处测定各管的光吸收值，将读数填入下表。 光吸收值（A540 nm） 4. 空白 3. 标准 2. 发芽3、4天幼苗的酶提取液 1.干燥种子的酶提取液 试管号 4.计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即： A标准 C标准 —— ＝ —— A未知 C未知 则：c（酶液管中麦芽糖的浓度）= A酶×C标准／A标准 式中：c为浓度； A为光吸收值。 ? 本实验规定：25℃时3分钟内水解淀粉释放1 mg麦芽糖所需的酶量为1个活力单位。 则15粒种子或15株幼苗的总活力单位为： 总活力单位=c酶×n酶×V酶 式中：c酶为酶液中麦芽糖的浓度； n酶为酶液稀释倍数； V酶为提取酶液的总体积。