实验血红蛋白及其衍生物边的吸收光谱及.pptVIP

实验二 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定 目的要求 掌握722型分光光度计的使用 了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定 掌握血红蛋白标准曲线的绘制 实验原理 溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律 比色皿的使用 手持毛玻璃面，不可触碰光滑面 使用前要再用少量（大约1-2ml）待测溶液润洗1次 使用时比色皿光滑面对准光路 使用后及时清洗（用海绵刷沾取肥皂液清洗比色皿，并用自来水冲洗干净，随后用蒸馏水润洗1-2次） 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定 血红蛋白(Hb)与O2结合生成氧合血红蛋白(HbO2)，与CO结合生成碳氧血红蛋白(HbCO)。 因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础。 如HbO2在可见光波长400~600nm范围内有3个特征的吸收峰，其峰值分别在415、541和576nm处，当氧合血红蛋白转为碳氧血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，在波长419、540和569nm处出现三个特征的吸收峰，其中在500~600nm范围内2个特征的吸收峰如下图。 本实验先制备Hb及其衍生物，然后在不同波长下测其光吸收度，以吸光度（A）（又称光密度）为纵坐标，波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长。 仪器和试剂 1．仪器：试管；吸量管； 量筒；722型分光光度计；CO发生器。2．试剂： （1）浓H2SO4； （2）甲酸； （3）蒸馏水； （4）血红蛋白溶液。 （5）NaOH； 实验操作 用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，即制得全血。 （1）氧合血红蛋白（HbO2）液： 加蒸馏水20ml， 取全血0.1ml（3滴）盛于小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。（2）碳氧血红蛋白（HbCO) 液： 取上述HbO2液约5ml于试管中，通CO气体（浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10秒钟，HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液。 2．吸光度测定： （1）将如上制备的2种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一次读数均应用空白管调节零点和100%）。 （2） 先从波长500~600nm分别测定HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。 3.吸收光谱曲线的绘制 以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸收光谱必有一些差异，对722型分光光度计来说，峰值误差在±3nm~5nm波长内是允许的。 注意事项 思考题 1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍生物的吸收光谱有何意义？ 2、Hb属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特征反映它的什么结构成分？ * 分光光度计的使用 朗伯比尔定律： A=εlc ε：摩尔吸光系数 c：溶液的浓度 l：液层的厚度 A：物质的吸光度 540 569 2 HbCO 541 577 2 HbO2 吸收光谱（nm） 吸收峰数 项目 预热仪器 选定波长 调节T=100％ 调节“0”点 测定 关机 分光光度计的使用 1．样品的制备： 分光光度计应放在干燥处，使用温度为5~35℃。远 离强电场、磁场 每次做完实验时，应立即洗净比色皿 为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿 暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时 切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记