基因工程菌的发酵.pptVIP

第十四章 基因工程菌的发酵 第一节 工程菌的来源和应用 一、何谓基因工程 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 基因工程的核心技术是DNA的重组技术。 重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。 除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。 基因工程一般分为4个步骤： 取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”； 将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA； 把重组DNA引人某种细胞； 把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 二、工程菌的获得 确定目的产物。 找出产该产物的细胞。 将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。 利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。 将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。 将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。 三、工程菌应具备的条件 发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。 菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 菌株不是致病株，也不产内毒素。 代谢控制容易进行。 能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。 四、工程菌的应用 1，基因药物 红细胞生成素 胰岛素 干优素 乙肝疫苗 生长激素 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 2，其它发酵产品 酶制剂 氨基酸（苏氨酸、色氨酸） 抗生素 第二节 工程菌的培养 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。 一、安全问题 关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。 1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，制定了有关DNA重组实验的准则，其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。 这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。 生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。 二、工程菌培养的特点 工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。 为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。 工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。 三、工程菌的培养 工程菌的营养控制 质粒稳定性 重组质粒拷贝数的控制及表达效率 1，底物浓度的控制 在基因工程茵培养过程，至少要遵循PI级物理防护的规定，因此必需进行菌体的高密度培养。 从生物安全性考虑，培养的基因工程菌通常是维生素或氨基酸的营养缺陷型突变株。 2，质粒稳定性 （1）质粒不稳定的类型 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。 （2）影响质粒稳定的因素 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响 宿主对质粒稳定的影响 质粒拷贝数 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 （3）使质粒稳定的措施 组建合适载体 选择适当宿主 施加选择压力 抗生素添加法 抗生素依赖变异法 营养缺陷型法