基因工程的基本操作程序 公开课.ppt

二、基因表达载体的构建（核心） 1.目的 三、将目的基因导入受体细胞------转化 受体细胞 （3）花粉通道法 我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得 2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序： 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）方法：Ca2+处理法（增加细胞壁通透性） （2）微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 （3）过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 四、目的基因的检测与鉴定 检测（分子水平）: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 个体生物学水平鉴定 （1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ① 首先取出转基因生物的基因组DNA； A 方法: DNA分子杂交 B 过程: ② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针； ③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。 1.检测 　 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。 * * 1.2 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 1.目的基因 符合人们需要，能编码蛋白质的基因 2.基因文库 P9 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 种类 基因组文库：含有一种生物的全部基因 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库 某种生物的全部DNA 限制酶 DNA片段 DNA片段与载体连接 重组DNA 基因组文库 导入受体菌中储存 ①基因组文库的构建 生物某个发育时期的mRNA 单链DNA 双链cDNA片段 重组DNA 与载体连接 cDNA文库 反转录酶 DNA聚合酶 导入受体菌中储存 ② cDNA文库的构建-----逆转录法： 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 3.获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术。 ②原理：__________ 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 ③过程： a、变性（90℃-95℃）：双链DNA在受热下，_____断裂，形成________ b、复性（55℃-65℃）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 ④方式：以_____方式扩增，即____ ⑤条件：前提条件:________________ ⑥ 结果： 指数 2n 短时间内大量扩增目的基因 已知基因的核苷酸序列 DNA复制 PCR技术 场所 解旋方式 酶 PCR技术扩增与DNA复制的比较 高温 解旋酶 体外复制 主要在细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 （3）人工合成法： 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成 化学合成法 、 反转录法 蛋白质 mRNA DNA 推测 推测 DNA DNA合成仪合成 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： A. 使目的基因在受体细胞中稳定存在