07-工基因工程克隆方案设计.pptVIP

基因工程克隆方案设计 基因工程实验设计 1、目的基因的序列分析 2、载体的选择和分析 3、克隆策略的设计 4、引物的设计 目的基因的序列分析 1、分析 ORF： 找到需要克隆的核酸序列 2、分析酶切位点： （1）酶切位点为0的酶；可通过引物加入，方便克隆； （2）酶切位点为1和2的酶：用于酶切克隆或基因和重组质粒的酶切分析。 载体的选择和分析 1、根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其它用途。 2、MCS(多克隆位点）是否有合适酶切位点（一般是基因上没有或1个的酶切位点) 3、表达载体，要注意表达框架配对。 4、载体的酶切位点，用于重组鉴定。 克隆策略的设计 1、平端克隆； 2、粘端克隆 （1） TA克隆 （2） 单酶切不定向克隆 （3）双酶切定向克隆 平端克隆 机械打断，化学合成，Eco R V酶切，或其它酶切位点末端改造（klenow 酶补平，S1处理）产生平端； 克隆效率较低，ligase 要加大量； 载体需脱磷； 方向可正可反。 TA克隆 1、普通Taq酶扩增的PCR产物3‘末端会多加一个A; 2、公司提供的T-vector的5’末端有一个粘性的T; 单酶切不定向克隆 载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）；