PfuDNA聚合酶的制备过程及其条件优化.PDFVIP

22 卷 4 期 生命科学研究 灾燥造援22 晕燥援4 年 月 圆园18 8 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡 Aug. 圆园18 DOI ：10.16605/ki.1007-7847.2018.04.005 Pfu DNA 合酶的制备过程及其条件优化 慧 曹贤明 李昱龙 涂中华 樊 奔* , , , , ( 京林业大学 方现代林业协同创新中心; 南京林业大学林学院, 中国江苏南京 210037) 要 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)可以方便 快捷 准确地大量复制目的基因片段, 是分 : 子生物学研究中不可或缺的技术手段 在PCR 反应中, DNA 聚合酶起着关键作用 Pfu 酶(Pfu DNA polymerase) 遥 遥 是DNA 聚合酶的一种, 具有5 3 聚合酶活性和3 5 外切核酸酶活性, 可在聚合酶链式反应中纠正错误掺 入的碱基, 可以快速 高保真地扩增DNA 片段, 在分子克隆和DNA 测序当中运用十分广泛 本研究建立 一 遥 套Pfu 聚合酶表达与纯化的详尽方案, 该方案利用异丙基硫代 - -D- 半乳糖苷(isopropyl -D-thiogalactoside, IPTG)作为诱导剂, 在大肠杆菌BL2 1 (DE3) 中异源表达Pfu 酶, 然后利用Ni-NTA 柱层析纯化制备 研究中对 遥 IPTG 诱导时间 细胞破碎条件 缓冲液类型及其pH 粗酶液热处理温度与时间 洗脱液中最佳咪唑浓度等重要 条件和参数分别进行了优化确定 实验结果表明, 使用该方案可以成功制备高产量高纯度的Pfu 聚合酶, 完全 遥 满足常规PCR 反应的要求 本研究建立的实验方法和技术参数, 十分适用于研究者小规模自主制备Pfu 酶, 对 遥 于有大量分子克隆要求的课题组, 利用该方案自主制备Pfu 酶能够显著节省科研成本遥 关键词 聚合酶链式反应(PCR); DNA 聚合酶; Pfu 酶; 蛋白质纯化; Ni-NTA; 制备方法 : 中图分类号 Q93-31 文献标识码 A 文章编号 1007 7847(20 18)04 0291 07 : : : - - - Preparation of Pfu DNA Polymerase with Optimi