树脂型PCR产物纯化和胶回收试剂盒.docVIP

树脂型PCR产物纯化及胶回收试剂盒 操作方法 （一）从反应液中回收PCR产物 将0.4ml纯化树脂（使用前充分混匀）与50~100μl无石蜡油的PCR反应液颠倒混匀3分钟。然后装入离心纯化柱，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 加入500μl 80%异丙醇（或乙醇），13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 重复第2步一次，此步骤13,000rpm离心2分钟，务必将异丙醇（或乙醇）除尽。如果离心纯化柱上还残留有异丙醇（或乙醇），13,000rpm再离心1分钟。 将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，开盖放置2~3分钟，使残留的乙醇充分挥发干净。加入50μl TE缓冲液（若用于测序，则加50μl超纯水）于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13,000rpm离心30秒。 TE缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。 离心管中的液体即是纯化的PCR产物，取4μl电泳（0.8%琼脂糖，120V，10分钟）检测并目测定量。-20℃ （二）从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段 将无石蜡油的PCR反应液或酶切反应液（50μl~100μl反应体系）在1%的普通琼脂糖凝胶上电泳，切下所需的DNA条带装入2ml离心管中。 尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶，这样可简化操作、提高回收量及DNA片段的质量。 200mg~400mg琼脂糖凝胶中加入0.4ml纯化树脂（使用前充分混匀），70℃保温5~ 对于高浓度的琼脂糖凝胶（2%），每200mg的琼脂糖凝胶中加入0.5ml纯化树脂，加热融胶的时间延长到15分钟。 将混和液转移入离心纯化柱，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 加入500μl 80%异丙醇（或乙醇），13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 重复第4步一次，此步骤13,000rpm离心2分钟，务必将异丙醇（或乙醇）除尽。如果离心纯化柱上还残留有异丙醇（或乙醇），13,000rpm再离心1分钟。 将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，开盖放置2~3分钟，务必使乙醇充分挥发干净，加入40μl TE缓冲液（若用于测序，则加40μl超纯水）于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13,000rpm离心30秒。 TE缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。 离心管中的液体即是纯化的DNA片段，取4μl电泳（0.8%琼脂糖，120V，10分钟）检测并目测定量。-20℃ 常见问题及参考意见 常见问题 可能原因 参考意见 回收率低 琼脂糖胶块未完全融化 尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶 400μl的纯化树脂中不要超过400mg琼脂糖凝胶 增加温育时间至15分钟，每2分钟混匀一次 琼脂糖凝胶浓度过高 配制0.8%~1.0%的琼脂糖凝胶进行回收 某些琼脂糖凝胶不容易被融化 更换琼脂糖，情况可能会变好 纯化树脂（于GS结合液中）有结晶出现 将纯化树脂（于GS结合液中）置于37℃温浴30min 洗脱温度过低 加入无菌超纯水或TE浸透树脂后，于37℃ 回收片段过大或过小 最适宜的回收片段为200bp~5Kb 回收的DNA片段在后续实验中出现问题（例如连接失败） 盐的浓度过高 用80%乙醇漂洗回收产物 增加漂洗次数 残留有有机试剂 增加离心时间，将80%乙醇或异丙醇去除干净 EB染色须在紫外线下切胶，紫外线的照射损伤了DNA片段 在长波紫外线下切胶 尽量缩短切胶时间 建议用其它DNA染料代替EB（例如GoodView?染料），在自然光下切胶 在胶里和电泳缓冲液中加入DNA紫外防护剂 部分双链DNA变性为单链DNA 在进行后续酶反应时，加入除酶以外的其它成份，通过95℃ 2分钟，再缓慢冷却至室温（25 用含有10mM NaCl的Tris Buffer洗脱DNA片段。（注意：盐的浓度可能影响后续实验） DNA片段易降解 DNA在酸性环境中脱嘌呤 用pH7.0的无菌超纯水或TE洗脱；若非用于测序，最好用TE