细胞培养技术修改版.doc

PAGE PAGE 13 实验一 实验准备工作 一、器材与药品（每实验室准备量） （一）普通器材 名 称 数 量 备 注 普通天平 1台 大酒精瓶 3只 量筒 1000ml、250ml各一只 500ml盐水瓶 1只 玻璃棒 2支 火柴，标签纸，记号笔等 （二）无菌器材 名 称 数 量 备 注 100ml或250ml盐水瓶 70只 大翻 70个 10ml吸管 3支 5ml吸管 5支 1ml吸管 1支 青霉素瓶 120只 青霉素瓶塞 120个 （三）药品 名 称 数 量 备 注 重铬酸钾 2400g 浓H2SO4 4000ml 双蒸水 5000ml 由技术室提前准备 青霉素 10000单位/ml 链霉素 10 000μg/ml NaHCO3， KCl ，NaCl，Na2HPO4·12H2O， KH2PO4，结晶紫，甲醛，无水酒精等 二、实验内容 （一）配清洁液 成 分 量 备 注 重铬酸钾 2400g 重铬酸钾溶于水中有时不能完全溶解，预先用2000ml热水助其溶解，再加入足量自来水，最后缓慢加浓硫酸。 浓硫酸 4000ml 自来水 20000ml 切记：浓硫酸要缓慢加入，且边加边搅拌！ （二）其他培养用液的配制及分工（学生分为三大组） 1、RPMI-1640培养液 成分 量 备 注 RPMI-1640 2袋 搅拌溶解后过滤除菌，每瓶按100ml分装，塞好大翻，并注明名称配制日期和组别。每实验室20瓶。每小组1瓶。 NaHCO3 4.0 g 2000ml大酒精瓶1只；无菌100ml盐水瓶20只。 2、无菌分装5.6％NaHCO3 成分 量 备 注 无菌5.6％NaHCO3 50ml 按照3ml/瓶分装，每室16瓶，每小组1瓶。无菌操作。 无菌青霉素瓶16只；无菌5ml吸管1支。 3、无菌分装1％胰酶（技术室提供） 成分 量 备 注 无菌1％胰酶 20ml 按照1ml/瓶分装，每室16瓶，每小组1瓶。无菌操作。 无菌青霉素瓶16只；无菌1ml吸管1支。 4、Hanks＇液（母液由技术室提供） 成分 量 备 注 A液 100 按照1：1：18比例进行配比混匀，总量为2000ml，过滤除菌，然后按照每瓶500ml分装，并注明名称配制日期，每室4瓶。 B液 100 双蒸水 1800 无菌10ml吸管2支，1000ml量筒1只，1000ml大酒精瓶1只，无菌100ml盐水瓶20只。 5、双抗 成分 量 备 注 青霉素（80万U） 2瓶 配制双抗终浓度为： 16000单位/ml；链霉素10000μg/ml。按5ml/瓶分装，瓶口贴好胶布作好标记，胶布上注明配制日期和组别。每室16瓶。每小组1瓶。－20℃保存备用。 链霉素（1g) 1瓶 无菌Hank s＇液 100ml 无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶16只。 6、血清的灭活和分装 成分 量 备 注 无菌小牛血清 150ml 总量为150ml， 56℃的水浴锅中进行热灭活，灭活时间30min，后按照每瓶5ml分装，并在瓶口处贴好胶布作好标记，胶布上写好日期和组别。每实验室30瓶。每小组2瓶。－20℃保存备用。 无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶30只。 7、1×PBS配制 成分 量 备 注 NaCl 8.0 g 总量为1000ml，每瓶按70ml分装，用硫酸纸包好瓶口，待高压灭菌后第二天派人再换大翻保存。每实验室15瓶。每小组1瓶。 KCl 0.2g Na2HPO4·12H2O 2.9g KH2PO4 0.2g 去离子水 至1000ml 标好1000ml刻度的酒精瓶或1000ml容量瓶1只，无菌100ml盐水瓶15个。 8、染色液 成分 量 备 注 结晶紫 0.5g 溶解、混匀，滤纸过滤 甲醛 10ml NaCl 0.8g 无水乙醇 50ml 去离子水 加至100ml 250ml量筒1只，500ml盐水瓶1只。 9、分装VTP（由技术室提供） 成分 量 备 注 无菌VTP 70ml 无菌操作按4ml/瓶分装，并注明日期和组别。每实验室15瓶。 无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶15只。 ☆未特别说明上述试剂均放置2～8℃冰箱保存备用。 ☆每组完成后统一收好，下次再分配到各小组。 备注：常规实验室用品注意更换，包括酒精缸和酒精灯，棉球，一次性台布等。 实验二 鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养 一、实验目的 掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤； 掌握活细胞的显微镜下观察； 熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。 二、实验原理 离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细