流式细胞仪的原理.ppt

流式细胞术的原理 流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。 基本原理 流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml 光路 光源 检测信号 光电倍增管PMT HV 电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计：计算机 流 路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 μm 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦 FLOW CELL 光 路 光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列 散射光信号—前向散射光(FS) FSForward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小 散射光信号 – 侧向散射光 SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比 光路-荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号 荧光染料的特性 常用荧光染料的特性 光路 - 滤片特性 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) Unique 4-Color Single Laser Design PC7 Optics - Detectors Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 颜色补偿 各荧光染料发射的荧光信号有重迭, 因此要进行色补偿以除去重迭部分 光谱重叠需进行色补偿 减法颜色补偿 减法补偿 去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误 BD FACSCalibur 补偿试剂 全矩阵颜色补偿 全矩阵 在每个PMT上对于每一个荧光计算 “叠加荧光素” 的比率 通过矩阵去除或加上信号 EPICS XL Cytomics FC500 EPICS XL临床科研型流式细胞仪 EPICS XL 合理的光路设计 单激光激发四色荧光标准模式 确保在同一个细胞上获得最多的信息 EPICS XL 直线光路设计，光损失少 可互换式光学滤片，方便新染料的应用 四色荧光中的补偿 EPICS XL 采用最先进的通讯传输设计 光纤通讯与数字信号传输 EPICS XL中的PRISM功能将多张直方图浓缩在一张上 Cytomics? FC500 产品介绍：硬件 MCL 进样 MCL 自动模式. MCL 直接( 或手动) 模式. 单管固定位置进样. 可以暂停 / 旋转以方便随时添加刺激剂等 条码识别 样本混匀 FC500特点 1根激光同时激发5色荧光 2根激光可选 3种进样方式 4种直方图分辨率 5色荧光同时检测 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (RD1) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (RD1) 675BP