一章工具酶.pptVIP

连接反应是一个吸能的反应，E.coli 及其它细菌以NAD为能源，动物及噬菌体以ATP为能源 基因工程中常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶 连接酶的最佳反应温度是37℃，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此连接反应的温度一般在4~15℃，Tsc DNA连接酶在90 ℃以上高温仍保持活性。 底物DNA ① DNA纯度 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl等 ② DNA分子构型 切割效率：线性超螺旋质粒环状病毒DNA ③ 识别序列的侧面序列 大多数限制酶对只含有识别序列的寡核苷酸没有催化活性，其序列两端各延长一个或几个核苷酸后才能被有效切割。 ④ 位点偏爱 侧面序列的核苷酸组成与切割效率有关系。如pBR322 DNA上的4个Nae I的识别位点切割效率不同。 底物DNA ⑤ DNA甲基化 dcm和dam甲基化酶 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但Bam H I、Bgl II、Sau 3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有Eco R II等 哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基 解决方法： 对DNA进行有针对性的纯化； 加大酶的用量，1 μg DNA 用10U 酶； 加大反应总体积； 延长反应时间； 2）内切酶的用量 反应体系中内切酶的用量主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 当底物确定后，酶的用量视酶活性而定。酶活性高的用量少，反之则高。 容积活性（volume activity）：1ul酶液中具有的酶活性单位，即U/ul。 等量的两种DNA样品，由于含同种限制性核酸内切酶识别序列的密度不同，则酶量也不同。密度大的用酶多。 3）反应缓冲液(浓度（10×）mmol/L) 缓冲液成分 A B C D E Tris-Ac 330 Tris-HCl 100 500 100 100 Mg-Ac 100 MgCl2 50 100 100 100 K-Ac 650 NaCl 1000 1000 500 DTT 5 10 10 10 β-巯基乙醇 10 pH值（37℃） 7.9 8.0 7.5 7.5 7.5 4）反应温度 大多数内切酶的最适温度为37℃，少数高于或低于37℃.各种酶的最适温度见各产品说明书。 限制性内切酶的star活性 定义：某些限制性内切酶在特定条件下（高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等），可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为star活性。 如：Eco R I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’ 另，不同的酶产生star活性的条件不同，见书p73. 问题 1.从细菌中分离基因组DNA，经过识别GAATTC序列的6碱基酶长时间消化后，发现DNA分子未被切动，基因组大小为4Mb，造成该结果的原因是（） A.基因组中没有G B.基因组中没有A C.该细菌的DNA已经过甲基化修饰 D.所有酶切位点都位于基因内，而该限制性内切酶不作用于基因内 E.所有酶切位点都位于启动子及调控区内，而该限制性内切核酸酶只作用于基因内 2. 限制性内切酶的星号活性是指（） 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性 活性大大提高