赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达及基因免疫.pdfVIP

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX 的真核表达及基因 免疫 黄毕，鲍朗，钟琪，商正玲，张会东，张英 四川大学华西基础医学与法医学院，成都（610041 ） E-mail ：baolang@ 摘 要：目的在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因 HlyX 的重组质粒， 并检测其作为DNA 疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。 方法 以赖型钩端螺旋体全基因组 为模板，PCR 扩增出目的基因HlyX ，以质粒pcDNA3.1 为载体，双酶切构建重组质粒，转 化大肠杆菌 DH5а, 双酶切、PCR 及测序鉴定重组质粒。将构建成功的重组质粒转染 COS7 细胞，通过RT-PCR 、Western blotting 鉴定目的基因的表达。将重组质粒免疫BALB/c 小鼠， 每2 周1 次，共3 次，ELISA 法检测小鼠的体液免疫应答水平。结果 扩增出全长约 1100bp 的HlyX 基因，重组质粒经双酶切、PCR 及测序鉴定表明重组质粒构建成功。RT-PCR 检测 显示重组质粒转染组能扩增出约 1100bp 的目的基因片段，Western blotting 分析可见在40kD 左右出现特异性的目的条带。DNA 免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平（1/6591 ～ 1/19773 ）。 结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX 真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度 的特异性抗体，为其作为钩体DNA 疫苗的研究和开发奠定了基础。 关键词：钩端螺旋体；溶血素基因HlyX ；真核表达；基因免疫 由致病性钩端螺旋体所引起的钩端螺旋体病（钩体病）是世界范围内广泛流行的人兽共 患自然疫源性疾病。目前使用的全钩疫苗诱导机体产生的免疫保护不完全、保护时间短、菌 型间交叉免疫保护性弱，因此开发广谱、高效、持久的新型疫苗势在必行。DNA 疫苗的出 现为新型疫苗的研究带来了新的希望。本研究室曾将钩体内鞭毛蛋白基因制备 DNA 疫苗， 免疫动物后发现该 DNA 疫苗具有显著的免疫保护作用[1]，说明运用 DNA 疫苗预防钩体病 是切实可行的。 溶血素是钩体的重要毒力因子，可能在钩体致病、免疫过程起着关键作用，是重要的候 选疫苗[2] 。Branger 等[3,4] 曾以钩体溶血素相关蛋白－1 （hap-1,hemolysis associated protein-1 ） 基因构建 DNA 疫苗免疫沙鼠获得了较好的免疫保护效应。2003 年我国完成了赖型钩体 56601 株全基因组的测序工作，预测了九个和钩体溶血素相关的基因[2] 。HlyX 是九个溶血素 之一，已有研究表明，该基因只存在于致病钩体且基因序列在各型钩体中相对保守，在体外 能引起绵羊红细胞溶血[5] 。本研究前期工作已证实该基因编码的蛋白质具有较强的免疫原性 和细胞毒性，可能是钩体的免疫保护性抗原。本实验即以 HlyX 为目的基因，探讨其作为 DNA 疫苗的可行性，旨在为钩体 DNA 疫苗的研究和开发奠定基础。 1. 材料和方法 1.1 质粒、菌株与细胞株 钩端螺旋体 017 株，本研究室常规保种并定时感染豚鼠传代以保持毒力。真核表达质粒 pcDNA3.1 、宿主菌E.coliDH5а、COS7 细胞本研究室保存。 本课题得到国家自然科学基金）和教育部博士点基金（20040610049 ）的资助。 通讯作者：鲍朗。 - 1 - 1.2 生化试剂与培养基 PCR试剂盒购于TaKaRa公司；限制性核酸内切酶、DNA连接试剂盒及反转录试剂盒为 晶美公司产品；脂质体转染试剂、Trizol购自Invitrogen公司；去内毒素质粒提取试剂盒、胶 回收试剂盒、细胞可溶性蛋白提取试剂盒、6×His单克隆抗体、DAB显色液购自Tiangen公司； β-actin多克隆抗体购于精博