基于genome shuffling的高产nisin菌株的选育及性状分析-制药工程专业论文.docxVIP

摘 要 Nisin 是由乳酸乳球菌产生的具有抑菌作用的小分子多肽，因其能被人体内 的蛋白酶水解不会对人体造成伤害，所以广泛地应用于肉类、乳类等食品的防腐。 本论文以提高乳酸乳球菌 YF11 nisinZ 的产量为目标，利用硫酸二乙酯化学诱变 和对实验室保存的紫外诱变的菌株驯化培养构建 genome shuffling 的亲本菌株 库，经过 4 轮 genome shuffling，获得一株 nisin 高产菌株 F44，对 F44 的发酵培 养基以及发酵条件进行了优化；利用场发射扫描电镜进行了对 F44 与原始菌株 YF11 的细胞形态进行了观察；荧光定量 PCR 对 F44 与 YF11 中 nisin 合成相关 基因表达进行分析。获得了如下主要研究结果 ： 以 YF11 作为原始菌株，利用硫酸二乙酯诱变获得三株 nisin 产量和耐受性以 及葡萄糖耐受性都有所提高的菌株 H1、H2、H3，通过驯化培养的实验室保存的 紫外诱变的的菌株得到耐受性和产量都有所提高的菌株 U1、U2、U3，此六株菌 作为 genome shuffling 的出发菌株。 对此六株出发菌株 U1、U2、U3、H1、H2 和 H3 以原生质递归融合的方式进 行四轮 genome shuffling，以 nisin 耐受性和葡萄糖的耐受性作为筛选依据，获得 了一株性状良好的菌株 F44，它对 nisin 的耐受性为 14000IU/mL，葡萄糖的耐受 性为 16%，nisin 产量为 2994IU/mL，为原始菌株 YF11 的 2.92 倍，是 6 个出发 菌株中效价最高的菌株 U2 效价的 2.12 倍。 利用响应面法对 F44 发酵培养基以及发酵条件进行优化，发酵培养基初始 pH 7.15、半胱氨酸 0.28g/L、蔗糖 30.9g/L nisin 效价为 3400.24IU/mL，比优化前 nisin 的产量提高了 17%。在最优条件下对 F44 进行发酵罐发酵补料，并且控制 发酵液的 pH，nisin 产量最高可达 4023IU/mL，比未补料时提高了 18.3%。 电镜分析结果发现，高产菌株 F44 的体积要大于 YF11，大约为 YF11 的 1.217 倍。对荧光定量 PCR 结果分析发现 nisin 的合成基因 nisZ 的表达量是原始菌株 YF11 的 1.48 倍，抗性相关基因 nisI 的表达量为原始菌株 YF11 的 2.3 倍，翻译 后修饰基因 nisB、C、T 的表达量也都有不同程度的提高。nisFEG 的表达量与 YF11 相比呈现降低的趋势。这些结果为我们进一步的了解 nisin 合成相关基因功 能及提高 nisin 产量提供了重要的信息。 关键词： 乳酸乳球菌；nisin；genome shuffling；电镜分析；荧光定量 PCR； ABSTRACT Nisin, produced by Lactococcus lactis, is one of the antibiotic polypeptide. As it could be hydrolyzed by protease and would do no harm to our body, nisin is widely used in food industry for preservation. The objective of this study was to improve nisinZ production of the Lactococcus lactis subsp. Lactis YF11. The DES mutant method and the enrichment culture of the UV irradiation mutant stored in our lab were done for the construction of genome shuffling mutant pool. Four round of genome shuffling were employed to obtain the high nisin production strain. After shuffling the mutant strain named F44 was obtained. The response surface methodology was conducted to optimize the fermentation media and conditions of F44. FESEM analysis was done to study the cell mropholgy.The HYPERLINK /dict_r